白芥子涂法巴布剂处方优化及其对哮喘大鼠的预防作用

白芥子涂法巴布剂处方优化及其对哮喘大鼠的预防作用

哮喘是由各种细胞，尤其是脂肪细胞、嗜酸性粒细胞和t淋巴结引起的慢性呼吸道炎症。在易受影响的患者中，这种炎症可能会导致哮喘、气短、胸闷和咳嗽，通常发生在夜间和闲暇时间。近年来,世界上许多国家的哮喘病率和死亡率有上升趋势,我国哮喘的患病率约为1%,儿童可达3%,全世界约有1亿哮喘病患者,已经成为严重威胁公众健康的一种主要慢性疾病。尤其近年在国内经常出现持续的大面积雾霾天气,使呼吸道疾病患病率逐渐上升,有效治疗哮喘、提高生活质量刻不容缓。外敷法治疗哮喘的药物多以清代名医张璐的《张氏医通》所记载的“白芥子涂法”为基础制成。“白芥子涂法”中的药物主要为白芥子、延胡索、甘遂、细辛、生姜等,将这些药物捣碎后,用生姜汁调成糊状,贴于人体的肺俞等穴位处,利用人体在三伏天阳气旺盛,气血浮于表,皮肤松弛,毛孔张开等特点,加快药物透皮吸收从而达到较好的治疗效果。其中白芥子可利气豁痰,温中散寒,通络止痛;延胡索可活血、利气、镇痛、镇静;甘遂有泻水逐饮、消肿散结的作用;细辛可祛风散寒,治疗痰饮咳逆、风湿痹痛;生姜可散寒发汗,化痰止咳,和胃止呕。本方一方面可刺激穴位,疏通经络,调理气血,协调阴阳抗御病邪;另一方面,特定药物在特定穴位被吸收,能充分发挥药理作用。巴布剂(cataplasm)系指将药材提取物、药材或化学药物与适宜的亲水性基质混合均匀后,涂布于背衬材料上制成的贴膏剂。巴布剂具有给药剂量准确、血药浓度稳定、药量可控并缓释、载药量大、透皮效果好、无刺激、患者顺应性好等优点;同时,不含传统膏药所特有的黄丹、香油等物质,不会产生铅中毒、皮肤过敏等不良反应。上海雷允上药业的“复方紫荆消伤膏”是国内第一个获得新药证书的巴布剂产品。本研究采用现代制剂工艺与传统的外敷法治哮喘处方相结合,制备平喘巴布剂,系统研究了有效成分提取、巴布剂基质筛选、中药复方巴布剂制备及性质考察、药效学评价,为哮喘防治提供一种新型中药复方巴布剂。用现代新型制剂技术模拟三伏贴防治哮喘是中药现代化的具体体现。1实验试剂与仪器甘油(西陇化工股份有限公司,批号124152);聚乙二醇400(南京威尔化工有限公司,批号20120524);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司,批号20131114);甘羟铝(陕西太白山制药有限责任公司,批号20130302);柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司,批号T20100913);羧甲基纤维素钠(中国医药上海化学试剂有限公司,批号F20030626);聚丙烯酸钠(国际特品,批号231770A);白芥子、延胡索、甘遂、细辛均购自安徽省亳州市中药材市场;氮酮(北京化学试剂公司,批号010619);无纺布(浙江弘扬无纺新材料有限公司);隔离膜(佛山兰迪胶粘材料厂);蒸馏水,生姜油(由本所天然药物化学课题组提供);SD大鼠(军事医学科学院实验动物中心,动物合格证号SCXK-(军),雌雄各半,140~160g)。电热套(黄骅市新兴电器厂,型号ZDHW);电动测试仪(上海锴凯科技贸易有限公司,型号DG-2000A);小型实验用涂布机(上海锴凯科技贸易有限公司,型号TB-0612B);电热鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司,型号DZF-150);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司,型号FD-1-55);电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司,型号JM-B2002);电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司,型号BS110S)。2方法和结果2.1白色基质筛选2.1.1空白基质的制备空白基质各组分初始质量比为:甘油-水-乙醇-聚乙二醇400(PEG400)-氢氧化铝-柠檬酸-羧甲基纤维素钠-聚丙烯酸钠-聚维酮2∶8∶0.8∶0.4∶0.15∶0.15∶0.15∶0.5∶0.015。称取处方量甘油、乙醇、PEG400加入同一烧杯中,低速搅拌下分别加入处方量聚丙烯酸钠、聚维酮K30和羧甲基纤维素钠,搅拌均匀后作为A相;称取处方量氢氧化铝和柠檬酸,加入一定量水中,搅拌均匀后作为B相,搅拌条件下将A相和B相混合均匀即得空白基质。将配制好的空白基质倒入试验用小型涂布机中制备巴布剂,放入40℃恒温干燥箱中熟化1h,取出后室温放置成型,即得空白巴布剂成品。2.1.2传感器运动极值的测定—评价指标初黏力:初黏力是指物品的表面黏着力。测定方法为:将巴布剂剪成合适大小,除去隔离层后贴于电动测试仪(图1A)上方的台面上,在巴布剂上放置一个100g砝码,将传感器感应头朝上,调整上限位,使测头刚好将砝码顶起(不可顶翻),停留5s后,感应头自动向下移动,到达下限位后,停止移动,按下传感器的“PEAK”键,可得到传感器向下运动的极值,此极值作为初黏力值(单位N),重复3次,求平均值。剥离强度:剥离强度是指物体对另一个表面的附着力。测定方法为:将巴布剂剪成4cm×10cm大小,揭除隔离膜后,室温平衡2h,将其黏于洁净的不锈钢板上,用2kg辊筒来回滚压3次,放置20min。将不锈钢板竖直放置(图1B),将巴布剂上方剥离呈180°翻转后接一220g重物,记录巴布剂从钢板剥离的时间(单位s)。重复3次,求平均值。人体感官评价:随机选取6人,于手腕内侧贴敷相同面积巴布剂(2cm×2cm),按所述指标进行人体感官评价(表1)。2.2单因素白色基质处方的分析2.2.1布布剂含膏量的测定由于巴布剂涂布厚度直接决定了其含膏量(一般不少于0.1g·cm-2),因此通过测定巴布剂含膏量的方法,确定巴布剂涂布厚度。按已有处方制备不同涂布厚度的空白巴布剂,参考2010年版《中国药典》一部附录Ⅱ中含膏量测定第二法测定。将不同厚度巴布剂各取1片,除去盖衬,精密称定,置烧杯中,加水适量,加热煮沸至背衬与膏体分离后,取出背衬,用水洗涤至背衬无残留膏体,挥去溶剂,在105℃烘干箱中30min,然后移至干燥器中,冷却30min,精密称定,减失质量即为膏重,按标示面积换算成100cm2的含膏量(表2)。当涂布厚度为2.80,3.00mm时,其含膏量均大于0.1g·cm-2。考虑到巴布剂载药量,将涂布厚度暂定为3.00mm。2.2.2巴布剂基质评价固定其他条件,选择氢氧化铝、甘羟铝、氯化铝作为交联剂,制备空白巴布剂基质,评价其外观。以氢氧化铝为交联剂,基质黏性小,流动性大,气泡较少;以甘羟铝为交联剂,基质黏性大,流动性较小,气泡少;以氯化铝为交联剂,基质分层,无黏性。因此确定甘羟铝为交联剂。2.2.3基质的制备固定其他条件,根据基质涂布时延展性和人体感官评价结果,优化甘羟铝最佳用量。称取甘油10g,水40g,乙醇4g,PEG4002g,聚丙烯酸钠5g,柠檬酸0.75g,PVPK300.075g,CMC-Na0.75g,甘羟铝用量分别为0.25,0.35,0.50,0.75g,按2.1.1项下方法制备成基质。甘羟铝用量为0.50,0.75g时,无法均匀涂布;当甘羟铝用量为0.25,0.35g时,可均匀涂布于无纺布上,进一步进行其人体感官学评价。最终确定甘羟铝用量为0.35g(表3)。2.2.4关于聚苯钠的剂量研究固定其他条件,根据人体感官评价结果,优化聚丙烯酸钠最佳用量。最终确定聚丙烯酸钠用量为5g(表4)。2.2.5筛选最佳黏合剂固定其他条件,以人体感官评价作为指标,筛选最佳黏合剂:PVP-K30,明胶和CMC-Na(表5)。最终确定CMC-Na作为黏合剂。2.2.6正交实验结果以甘油(A,用量分别为15,20,25g)、柠檬酸(B,用量分别为1.0,1.5,2.0g)、CMC-Na(C,用量分别为1.0,1.5,2.0g)作为影响因素,以初黏力(单位:N)、剥离强度(单位:s)和人体感官评分结果为考察指标,设计L9(34)正交实验优化处方(表6)。由初黏力直观分析结果可知,各因素对巴布剂初黏力影响顺序为:甘油>柠檬酸>CMC-Na,最优处方为A3B3C1。由剥离强度直观分析结果可知,各因素对巴布剂剥离强度的影响顺序为:CMC-Na>甘油>柠檬酸,最优处方为A2B2C1。随甘油和柠檬酸用量增加,巴布剂初黏力也逐渐增加,因此确定最优处方为A2B2C1,即甘油用量为20g,柠檬酸用量为1.5g,CMC-Na用量为1.0g。最终确定最优空白巴布剂基础处方质量比为:甘油-水-乙醇-PEG400-甘羟铝-柠檬酸-羧甲基纤维素钠-聚丙烯酸钠2∶8∶0.8∶0.4∶0.07∶0.15∶0.1∶0.5。2.3中药有效提取物的提取2.3.1提取液-液法将处方量白芥子-延胡索-甘遂(2∶2∶1)粉碎成粗粉,装入1000mL圆底烧瓶内,置于电热套中,加入8倍量60%乙醇-水溶液,连接回流装置,保持微沸1h后,倒出提取液,再向圆底烧瓶中加入8倍量60%乙醇水溶液,加热回流1h,合并2次提取液。将提取液转入茄型瓶中,70℃减压浓缩,将浓缩液分装在100mL烧杯中(不超过烧杯1/5),于-20℃冷冻。冷冻干燥24h后得到有效成分干粉。2.3.2挥发油提取器、世界如何加热根据2010年版《中国药典》一部附录XD“挥发油测定法”中的甲法提取:取细辛适量置于1000mL圆底烧瓶中,加水适量与玻璃珠数粒,振摇混合后,连接挥发油提取器和回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油提取器的刻度部分,并溢入烧瓶为止。用电热套缓慢加热,保持微沸5h,直至测定器中油量不再增加,停止加热。放置片刻,打开测定器下端活塞,将水缓缓放出,至油层上端到达0线上面5mL处止。放置1h,开启活塞使油层下降至其上端恰好与0线齐平,读取挥发油量,收集挥发油备用。2.4含药巴布剂基质的制备称取甘油40.0g、无水乙醇16.0g、PEG-4008.0g于300mL烧杯中,称取聚丙烯酸钠10.0g、CMC-Na2.0g、细辛挥发油0.225mL、氮酮2.5g(为基质总质量的1%)和生姜油适量加入上述烧杯中,搅拌均匀作为A相;称取甘羟铝1.4g、柠檬酸3.0g、有效成分干粉10g于200mL烧杯中,加入蒸馏水160mL,搅拌均匀作为B相;将B相缓慢加入A相,沿同一方向缓慢搅拌均匀得到含药巴布剂。同法制备空白巴布剂基质和有效成分干粉量分别为10.0,30.0,50.0g的载药巴布剂(有效成分质量分数分别为4%,11%,17%),将上述巴布剂基质倒入涂布机储料槽中,涂布于无纺布上,并被覆隔离膜。放置熟化成型,得巴布剂成品。2.5有效成分干法量对巴布剂品质指标的影响依上法制备空白及载药巴布剂,测定其初黏力、剥离强度及人体感官评价指标(表8)。随有效成分干粉量增多,巴布剂总体感官评价不断变优,初黏力和剥离强度也逐渐增大。因此确定治疗哮喘用中药复方巴布剂含药量为:每100g巴布剂中含药量为17g(17%)。2.6中药复方巴布剂对哮喘大鼠模型的建立取SD大鼠25只,随机分为5组,每组5只:阴性对照组、阳性对照组(三伏贴,北京中西医结合医院院内制剂)、17%含药量组、11%含药量组、4%含药量组中药复方巴布剂。建立哮喘大鼠模型,具体操作如下(图2)。17%含药量组中药复方巴布剂对哮喘模型大鼠的挠鼻时间有显著抑制作用(P=0.037<0.05),11%,4%含药量组和市售三伏贴组在给药前后大鼠挠鼻时间无显著性差异(图3)。3感冒动物模型的制备巴布剂中基质选择十分重要,本研究以聚丙烯酸钠作为基质,羧甲基纤维素钠作为黏合剂,甘油和PEG400作为保湿剂,甘羟铝作为交联剂,通过单因素考察和正交设计优选出初黏力和剥离强度适宜,人体感官评价较好的巴布剂处方。美中不足是当有效成分质量分数为17%时,存在膏体脱落现象,下步工作尚需解决该问题。哮喘发病机制复杂、病理生理机制不明确,许多临床研究无法开展,因此复制接近人类哮喘病理生理状态的哮喘动物模型意义重大。支气管哮喘动物模型包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、犬、兔、羊、猫及灵长类等,常用动物为豚鼠。豚鼠易致敏,接受致敏物质后反应程度比较强,能产生I型变态反应。但豚鼠过敏反应差异较大,其变态反应多由IgG而非IgE介导,与人类不同。小鼠哮喘模型以其免疫、遗传背景清楚得到广泛应用。但也具有较多局限性:(1)不出现人类哮喘特征性的黏膜炎症及上皮层嗜酸性细胞浸润;(2)不出现人类哮喘典型的慢性气道炎症和上皮变化;(3)大多数模型出现过敏性肺泡炎和超敏性肺炎,掩盖了气道的炎症损害;(4)气道狭小,肺和支气管功能测定技术难度大。大鼠品系纯正、标本采集量大、对抗原反应较一致,能诱发