改良旁核注射微量催产素对大鼠胃缺血再灌注损伤的影响及其机制

改良旁核注射微量催产素对大鼠胃缺血再灌注损伤的影响及其机制

在大脑的pdv细胞中，有丰富的脉冲产素（oxytolin，ot），能神经细胞和高密度ot受体。对于pvn和pvn中的微注射ot，可以减少胃肠道的分泌，缓解溃疡。近年来,在研究缺血器官的细胞凋亡及增殖修复的细胞信号传导通路中,丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶Akt是一个细胞存活信号激酶,它可被胰岛素和各种生长因子通过PI-3K(phosphoinositide3-kinase)依赖的机制激活。激活的Akt作用于它的底物如Bad、糖原合成酶-3及caspases等,使其失活而促进细胞存活。我们曾发现电刺激PVN可减轻胃缺血-再灌注(gastricischemia-reperfusion,GI-R)损伤。本研究探讨了Akt在PVN内注射微量OT对GI-R损伤影响中的作用机制。1材料和方法1.1免疫组织化学p-Akt(ser473)小鼠单克隆抗体、cleavedcaspase-3(Asp175)兔多克隆抗体(Cellsignaling公司);PowerVisionTM二步法免疫组化检测系统、DAB显色试剂盒、枸橼酸盐缓冲盐溶液、碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG和多聚赖氨酸溶液(北京中杉生物技术有限公司);碱磷酶底物NBT/BCIP显色浓缩液(PromegaTechnology公司)。其他试剂均为市售化学纯。1.2pvn微量注射是治疗di-r损伤的有效方法4～5月龄、体质量230～250g的健康SD大鼠(本院实验动物中心),雌雄不拘。实验前禁食24h、自由饮水。动物在麻醉下(腹腔注射10%水合氯醛400mg/kg),按文献方法定位PVN或侧脑室后,在2min内将OT24、120、600和3000ng/0.3μL微量注射到PVN(每个剂量组均为6例),或在PVN微量注射OT和GI-R之前,将atosiban1.2μg/5μL注射到侧脑室,以观察PVN微量注射OT对GI-R损伤的保护效应是否由中枢内的OT受体介导。溶剂对照组注射等体积的生理盐水。按文献方法制备大鼠GI-R模型。1.3损伤分数的测定参照Guth等方法加以改进。正常为0分;损伤小于1mm计1分;1～2mm计2分;2～3mm计3分;余类推。损伤宽度超过1mm时,分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为胃黏膜损伤指数(gastricmucosaldamageindex,GMDI)。测量完损伤指数的胃沿胃大弯剪开,一半腺胃在冰盘上快速剪取胃黏膜,置-80℃冰箱备用。另一半腺胃部分在10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片后用于免疫组化。1.4免疫组织化学染色法按试剂盒说明进行染色,用图像分析软件对阳性细胞数或表达强度进行半定量分析。1.5caspase的制备将已制备的细胞蛋白提取液测其蛋白浓度后,经100℃水浴变性5min,按每孔30μL蛋白上样,经10%SDS分离后,以湿转移法转至NC膜上,室温封闭3h,加入一抗(p-Akt1∶200、caspase-31∶1000),4℃过夜,洗膜后加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗,室温孵育2h,洗膜后加入显色剂(NBT/BCIP显色试剂盒),反应达到要求后流水洗涤终止反应。条带经图象处理仪行激光扫描后测各条带吸光度(A)值,以相应区带的吸光度值相对于对照组的倍数表示。1.6统计分析数据以均数±标准差(x—±s)(x—±s)表示,多组间比较采用完全随机设计方差分析法(ANOVA)。2结果2.1剂量依赖的保护作用单侧PVN内微量注射OT(24、120、600和3000ng/0.3μL生理盐水)后,剂量依赖性减轻胃黏膜损伤。其中600ngOT可产生非常明显的保护效应(n=6,P<0.01)(图1)。因此本实验采用600ng作为以后实验的剂量。2.2侧脑室ot受体抗剂的影响侧脑室注射atosiban1.2μg可完全阻断OT(600ng)减轻GI-R损伤的效应(P<0.05,表1)。2.3atosiban检测PVN微量注射OT(600ng)可明显增加GI-R1h后p-Akt蛋白的表达水平(P<0.01),而atosiban可取消OT的这种效应(表1,图2)。2.4atosiban对caspase-3蛋白水平和atosiban表达的影响GI-R1h后胃黏膜caspase-3蛋白水平较高,PVN微量注射OT(600ng)后,caspase-3蛋白水平较GI-R组明显减少(P<0.01),而atosiban可阻断OT的这种效应(P<0.01)(表1,图3)。3pvn参与了多通道药物治疗对ga-r损伤的影响本研究发现单侧注射微量OT到大鼠PVN后,能剂量依赖性减轻GI-R损伤,OT受体拮抗剂atosiban可阻断该效应,表明OT减轻GI-R损伤的作用可能是通过PVN内的OT受体实现的。我们曾发现电刺激PVN可减轻GI-R损伤,由于电刺激PVN时可同时兴奋PVN内的多种神经元,其中包括OT能神经元,并且PVN内的OT能神经元对胃的多种生理功能具有调控作用,如胃电刺激2h后可明显增加PVN内OT阳性神经元的表达;PVN内注射OT后,胃酸排出量减少;电刺激PVN对胃运动的抑制作用可被迷走神经运动背核或侧脑室内注射OT受体拮抗剂所阻断。因此,我们推测PVN内注射OT后,由于胃酸排出量减少,胃运动减弱,从而减轻了GI-R损伤。本研究的另一个重要发现是,PVN给予OT能明显增加p-Akt在胃黏膜细胞中的表达及降低caspase-3的蛋白水平,而atosiban取消了这些效应,表明OT能通过激活胃黏膜细胞Akt信号通路,从而减轻GI-R损伤。Akt是在体或离体组织器官缺血再灌注后细胞存活的一个重要调控因子。Akt的磷酸化和激活参予多种组织器官缺血预处理的保护作用,例如心肌缺血预处理,而使用PI-3K抑制剂LY294002和wortmannin可阻断缺血预处理对心肌的保护作用;其他重要脏器如脑、肝脏及肾脏等缺血预处理时均可明显增加p-Akt蛋白表达水平,降低caspase-3的蛋白水平,从而减轻缺血再灌注损伤。Akt信号通路的激活也参与其他因素如HGF-MSP减轻肾脏缺血再灌注损伤及脂多糖减轻心肌缺血再灌注损伤的过程,并伴有caspase-3蛋