应激大鼠脑边缘系统内一氧化氮合酶阳性神经元的分布

应激大鼠脑边缘系统内一氧化氮合酶阳性神经元的分布

由于生境的快速变化和栖息地脆弱性，以往的文献主要集中在动物行为的观察上（江燕等人，2000；邵邻平等，2002），但对动物脑中神经元变化的报道很少。脑边缘系统与动物的嗅觉和内脏活动有密切关系,并参与个体生存和种族繁衍功能(如觅食、防御、攻击、情绪反应和生殖行为等),海马还与高级神经活动记忆有关(于频,1996)。本研究利用动物食物链的捕食关系,建立恐惧应激模型,采用NADPH-d酶组织化学方法观察实验动物脑边缘系统皮质、海马、纹状体和下丘脑NOS阳性神经元的变化,探讨劣性应激对脑内神经元的影响并提供形态学依据。1材料和方法1.1实验动物及动物选用雄性Sprague-Dawley大鼠(南京汤山青龙山实验动物中心提供),体重220-250g。自由饮食,20-30℃条件下饲养。1.2实验模型的制备将80只雄性SD大鼠随机分为单纯捕食应激组(n=30)、加强捕食应激组(n=30)和对照组(n=20)。捕食应激实验箱为1m×1m×1m铁丝笼,中间固定一个20cm×20cm×20cm的小铁丝笼,以便在实验中将鼠放入其中,笼中设一蜂鸣器。先将鼠放入捕食应激实验箱的小笼中,在蜂鸣器鸣叫的同时将一只饥饿的猫放入实验箱中。模型制备参照王庆松和张建华(2001)的方法并加以改进:单纯组鼠与猫无生理伤害接触10min/d;加强组鼠与猫无生理伤害接触10min/d后4h,被再次置于实验环境中静置10min,但蜂鸣后不再放入猫;对照组鼠除不接触猫外,其它处理程序相同。1.3灌注0.9%盐水、多聚甲醛,添加20%蔗糖溶液各组动物分别于应激1、3、6、12、21、30d的第2d上午进行。10%水合氯醛(40mg/kg)腹腔麻醉,经左心室依次灌注0.9%生理盐水(200ml左右),4%多聚甲醛(0.1molPB,pH7.2)250ml;取脑,4℃后固定4-48h,再置于20%蔗糖溶液(0.1molPB,pH7.2)4℃过夜;冰冻切片,片厚40μm,收集于0.1mol/LTris-HClbuffer(pH7.6)中备用。1.4瘪c-l-4-气调包装主要试剂:NADPH-d购自Sigma公司,其余试剂均为国产。染色方法参照Heatheretal.(1997)。经Tris-HClbuffer漂洗5min×3次,入孵育液37℃水浴1-2h。孵育液的组成:由0.1mol/LTris-HClbuffer(pH7.6)配制,内含0.25mg/mlNBT,1mg/mlβ-NADPH,0.2%Tritonx-100。然后用0.1mol/LTris-HClbuffer终止反应并充分漂洗,APES玻片裱片,室温中干燥;脱水、透明和封片。对照液:无NADPH的孵育液。1.5nos活性测试1.5.1nos阳性神经元按大鼠脑立体定位图谱(包新民、舒斯云,1991),在光镜下观察皮质、纹状体(选其尾壳核)、下丘脑、海马CA3区等部位NOS阳性神经元。经NADPH-d酶组织化学法染色后,脑内NOS阳性神经元及其纤维呈蓝色,阳性物质积聚于胞浆和突起内;毛细血管也染成浅蓝色。阳性神经元可分为强阳性、中等和弱阳性三种类型。强阳性NOS神经元染成深蓝色,弱阳性NOS神经元着色较淡,中等强度介于二者之间。1.5.2nos阳性细胞数和均数的统计统计方法参照刘辉等(刘辉等,2000),每只大鼠取2张切片,在光镜下分别随机选皮质、纹状体尾壳核、海马CA3区、下丘脑室旁核和室周核各3个视野(10×40);统计NOS阳性细胞数,算出每个视野的均数。结果以平均值±标准误(mean±SE)表示,应用Minitab13.3统计软件,采用单因素方差分析进行3组间的比较。2应激对海马nos活性的影响NOS阳性神经元分布于脑边缘系统各部,对照组活性平稳,但应激后NOS活性变化明显。与对照组比较,应激1-3d,单纯应激组和加强应激组大鼠NOS阳性神经元数目在大脑皮质、纹状体、海马CA3区、下丘脑室旁核和室周核等部位增多,即NOS活性升高。第4-12d,NOS活性进一步升高,除皮质外,海马CA3区在应激第6d,纹状体尾壳核、室旁核和室周核在应激第12d时NOS活性变化显著(P<0.01)。第13-30d,NOS阳性神经元的活性开始逐渐降低,到第30d应激单纯组和加强组各脑区NOS活性下降明显,染色变浅、突起变短,有一些阳性细胞胞体也开始变小;但与对照组相比仍具显著差异性(P<0.05)。对于同一时间点而言,与对照组相比,加强应激组较单纯应激组NOS活性变化更为明显;这可能与加强应激组大鼠更持续处于紧张“恐惧”的心理应激状态密切相关(表1)。皮质内可见中等染色密度的NOS阳性纤维,纤维较细,带有小的膨体相互编织成网(图版Ⅰ:1),应激后皮质变化不明显。需说明的是,应激过程中皮质的某些区域NOS神经元有较明显的增多,如梨状区和内侧中央前区等,但从整个皮质看,其变化不显著。这或许是由于皮质不同区域具有不同功能的缘故。海马CA3区NOS阳性神经元与皮质相比差异较大,其密度虽接近于皮质,但颜色明显浅淡呈弱阳性,突起短小,阳性纤维远较皮质稀疏(图版Ⅰ:2)。应激第6d,应激加强组海马内NOS阳性神经元数目增多,染色呈中阳性;与对照组相比,有显著差异性(P<0.01)(图版Ⅰ:3)。纹状体尾壳核内NOS阳性神经元染色深,其阳性纤维比皮质更为密集,互相交织成网(图版Ⅰ:4)。应激第12d,应激加强组大鼠尾壳核内的NOS阳性神经元增多;与对照组相比,有显著差异性(P<0.01)(图版Ⅰ:5)。下丘脑室旁核阳性神经元既有大细胞,又有小细胞,着色深浅者皆有(图版Ⅰ:6),室周核及下丘脑外侧区仅有几个NOS阳性神经元。应激第12d,应激加强组大鼠下丘脑室旁核的NOS阳性神经元增多;与对照组相比,有显著差异性(P<0.01)(图版Ⅰ:7)。应激第12d,单纯应激组大鼠下丘脑室周核的NOS阳性神经元增多(图版Ⅰ:8)。3应激对nos活性的影响一氧化氮具有神经递质的作用,但过量增多的NO又具有神经毒性(金惠铭、孟淑兰,1997)。介导神经损伤的NO来源于NOS阳性神经元。实验结果表明,应激可导致脑边缘系统NOS阳性神经元的表达增加,即NO的增多,使脑边缘系统的神经元功能受损。在应激早期,NOS活性增高,尤其是介导应激反应的重要脑区海马和下丘脑室旁核NOS活性变化明显。海马在第6d和室旁核在第12dNOS活性为最高(P<0.01),但随着应激时间的延长其活性和阳性细胞数开始逐步减少,这一结果与金玉祥等结果相似。金玉祥等(2000)通过足底电击加噪音刺激应激模型观察了应激1d、3d、6d、9d、15d大鼠脑内NOS阳性神经元的变化,发现第1d-6d脑内NOS活性逐步升高,以第6dNOS活性为最高;之后,其活性下降,到第15d阳性细胞数量下降且染色浅淡。有人通过急性束缚应激大鼠4h后发现大鼠下丘脑室旁核NOS阳性神经元的NOS活性增强(宋春杰等,1997)。Lezaetal.(1998)报道,在应激早期4-9d,鼠脑组织中即有NO的增加,其后9-14d海马神经元受到损害。张艳美等(2002)对强迫游泳(15min/d)4周大鼠的研究发现,其海马内NOS阳性神经元表达增加,NO增多,海马CA3区锥体细胞受到损害。目前的研究认为过度生成的NO产生的神经毒性作用是应激导致脑内神经元受损的原因之一,本文的结果支持这一观点。本实验中NOS活性变化与其它文献时程上的差异,可能与应激类型、强度和时间的不同所造成的应激反应程度的不同有关。在应激早期,应激刺激激活了兴奋性氨基酸受体,使细胞内游离钙增加,导致NOS活性增强。此外,在应激状态下,中枢神经递质系统也参与了反应,使一些神经递质和激素水平升高,例如大脑内乙酰胆碱、血管紧张素等增高均可激活NOS(Zhu,1996)。NOS活性升高后随着应激时间的延长而下降原因可能如下:(1)应激反应中,机体可通过各种复杂的中枢机制来减轻应激引起的神经元的损伤;有研究者认为,在神经损伤中,神经细胞可通过表达内源性神经营养因子(如CNTF,NGF等)来减少NOS阳性神经元的表达进而减少NO的生成(陈秀青等,2000);(2)过度生成的NO在损伤其它神经元的同时也使NOS阳性神经元受到损伤,从而使NOS阳性神经元数目减少(金惠铭等,1997)。应激反应时,机体可通过各种代偿机制维持内环境的相对稳定,但过于持久或强烈的应激会破坏这种平衡,使机体受损。近年的研究提示,应激超过一定的时程(3-4周以上)则可能导致脑内神经元受到损害(Bruce,1999;Dumanetal.,1999;Checkley,1996;Magarinosetal.,1995)。作者认同这一观点,认为捕食应激过程中由于NO的过量生成可导致脑边缘系统神经元受损。与应激前、中期相比,应激第30d应激组NOS阳性神经元的活性和数量明显下降;与对照组相比,其NOS