猪脑内lepin长形受体mrna分布定位

猪脑内lepin长形受体mrna分布定位

leptin是脂肪细胞分泌的含有167个氨基酸的蛋白质激素。它可以调节动物的摄食量、能量代谢、生长、繁殖、内外分泌和免疫等。据报道,leptin受体(OB-R)有5～6种剪接体,其中OB-Ra、c、d、e、f为短形受体,OB-Rb为长形受体。只有OB-Rb具有信号转导功能,为功能性受体,主要分布于脑内[1,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。近年来对人、啮齿类、羊和猪脑内OB-Rb的分布定位研究表明,脑内OB-Rb和OB-RbmRNA除分布于下丘脑、大脑皮质、梨状皮质、内嗅皮质、海马和杏仁核外,还分布于丘脑、小脑和延髓。文献中仅见用RT-PCR法研究了猪丘脑、小脑和延髓的极后区内OB-RbmRNA的表达,但OB-RbmRNA在上述脑区内分布于那些核团和层次,与其功能有何联系,在瘦型猪和肥胖型猪有无差异?文献中未见报道。本实验用原位杂交法研究了猪丘脑、小脑和延髓一些结构内OB-RbmRNA的核团分布定位,比较瘦肉型的长白猪与我国较肥胖的梅山猪上述脑区内OB-RbmRNA分布的差异,为研究OB-Rb与其他神经肽的相互关系、探讨leptin作用的部位及其生理功能提供形态学资料。1材料和方法1.1实验动物2～3月龄健康长白三元杂交猪5头,购自南京象山种猪场。2～3月龄健康纯种梅山猪5头,购自江苏省小梅山猪育种基地。1.2宝灵曼公司的纺粘设备地高辛RNA标记试剂盒、原位杂交显色试剂购自宝灵曼公司。Trizol、逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ酶、ApaⅠ酶、SacⅠ酶等试剂购自上海生物工程有限公司。1.3rt-pcr法合成4个细胞剂-5-内酰胺5.用Trizol法提取长白母猪下丘脑总RNA。根据GeneBank上登录的猪leptin长形受体基因序列(GI3661588),在其保守区设计一对引物,由上海植物生理所合成。引物1:5′-CCTCCAGGAGAGCTGTTCAC-3′(+3360至+3379)。引物2:5′-GGCTCTTGAAGGCTTTCTCA-3′(+3683至+3702)。用RT-PCR法合成和扩增cDNA,可获得一343bp的目的片段。用QIAquickGelExtractionKit回收纯化PCR产物,通过TA克隆,将PCR产物直接连接到pGEM-TEasy载体上,然后转化到E.coliJM-109感受态细胞中。随后,对重组质粒进行筛选、提取、纯化和鉴定(由上海生物工程有限公司进行测序鉴定)。对测序鉴定正确的重组质粒进行扩增、提取,用ApaⅠ酶或SacⅠ酶使之完全线性化后,用地高辛RNA标记试剂盒合成Ob-RbcRNA探针。用斑点杂交实验检测合成的正意和反意探针浓度。-20℃保存备用。此外,本实验也使用了少量武汉博士德生物工程有限公司生产的OB-Rb寡核苷酸探针和原位杂交试剂盒。1.4载玻片的制备(1)取材、固定和切片:实验猪用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉(5ml/kg),用4%多聚甲醛/0.1MPBS经心或颈总动脉灌注,固定后取出丘脑、小脑和延髓,置同一固定液中后固定4～6h,然后浸入20%蔗糖/0.1MPBS中,置4℃直至脑块完全下沉。脑组织冰冻切片,片厚20μm,裱贴至用多聚赖氨酸预处理过的载玻片上,室温干燥。(2)原位杂交:切片置37℃烘箱干燥过夜后,按以下方法进行杂交反应:①杂交前预处理:切片顺次经过0.5%H2O2/甲醇、胃蛋白酶/3%柠檬酸等溶液。②预杂交和杂交:切片在预杂交液中预杂交(40℃)3h。然后切片在杂交液中杂交过夜(43℃,16h),杂交液中含地高辛标记的Ob-Rb反意探针(0.5μg/ml)。③杂交后处理:切片顺次经过递减浓度的SSC(37℃)、封闭液(37℃,30min)、生物素化鼠抗地高辛抗体(37℃,1h)、SABC(37℃,20min)、生物素化过氧化物酶(37℃,20min)等试剂。④显色:DAB显色30min(博士德生物工程有限公司DAB试剂盒)。然后干燥、透明、封片,明视野下观察结果、照像。(3)对照实验:杂交液中含地高辛标记的Ob-Rb正意探针(0.5μg/ml)或不加任何探针,其余步骤均相同,结果为阴性。2结果2.1r-pcr产物的电泳结果提取的下丘脑总RNA经反转录后进行PCR扩增,得到大小为340bp左右的扩增片段(图1),这与设计的RT-PCR产物大小一致。2.2岩石学和酶基因片段的鉴定重组质粒及酶切鉴定电泳结果见图2。从电泳结果可以看出,重组质粒(第4泳道)条带清晰,说明纯度较高;EcoRⅠ酶切片段(第3泳道)大小约340bp,与预计插入的目的基因片段基本一致;ApaⅠ酶(第1泳道)和SacⅠ酶(第2泳道)线性化cDNA完全。2.3综合固碳序列测定结果重组质粒经DNA序列测定,与已报道的猪Ob-Rb基因序列(GeneBank,GI3661588,+3360至3702)完全一致。2.4ob-rbrnna标记神经元含Ob-RbmRNA的标记神经元呈黄褐色,分布于丘脑、小脑和延髓。在丘脑内,Ob-RbmRNA标记神经元几乎分布于所有核团,在中线核、丘脑室旁核和丘脑前核内出现大量的Ob-RbmRNA标记神经元,其余核团Ob-RbmRNA标记神经元分布较少(图3-5)。在小脑,皮质三层中均出现Ob-RbmRNA标记神经元,以梨状神经元层和颗粒层分布较密集(图6)。在延髓,下橄榄核、孤束核、迷走神经背核和舌下神经核出现Ob-RbmRNA标记神经元(图7-10)。长白猪与梅山猪上述脑区内Ob-RbmRNA的分布定位无明显的差异。标记神经元呈现多种形态,有多边形、三角形、梨形、卵圆形等,因脑的部位及层次而异。在典型的Ob-RbmRNA标记神经元,胞核清楚,色浅,胞质深染,特别是核周区染色较深。说明Ob-RbmRNA主要位于胞质中,近核区密度较大。在使用Ob-Rb正意核酸探针或不加探针的对照实验中,上述结构中仅见背底染色,未见明显的Ob-RbmRNA标记神经元。3讨论3.1ob-rb探针的稳定性RT-PCR产物、重组质粒和酶切鉴定电泳结果及重组质粒序列测定结果表明,自制的Ob-RbmRNA探针与设计的探针大小一致,与GeneBank上登录的猪Ob-Rb基因序列完全相同,说明探针具有高度的特异性。本文使用少量博士德公司OB-Rb寡核苷酸探针也得到相同的结果,但其特异性不如自制探针的高。3.2ob-rb基因表达许多研究表明,Ob-Rb分布于丘脑、小脑和延髓。Yamamoto等人和Baskin等人报道,Ob-Rb免疫阳性神经元广泛分布于大鼠丘脑内,特别是丘脑前内侧核,Ob-Rb样蛋白质分布于胞浆核周区。Mercer等人和Udagawa等人分别报道Ob-RmRNA在小鼠和小鼠胚胎丘脑内表达。Lin等人用RT-PCR法研究发现,Ob-RbmRNA分布于猪丘脑、小脑和延髓的极后区。Couce等人和Burguera等人报道,Ob-R免疫阳性神经元和Ob-RbmRNA分布于人小脑的蒲肯野氏细胞和齿状核、下橄榄核和脑神经核(舌下神经核),特殊的杂交信号见于神经元胞体的胞浆、树突和近端轴突内。Mercer、等人报道,Ob-rbmRNA在小鼠外侧臂旁核、孤束核和延髓网状结构等处表达,但在大鼠的小脑高度表达,在孤束核表达较少,在外侧臂旁核不表达。本实验结果表明,Ob-RbmRNA分布于猪丘脑、小脑和延髓。在丘脑内,Ob-RbmRNA标记神经元几乎分布于所有核团,但在中线核、丘脑室旁核和丘脑前核内分布较密集。在小脑,皮质三层中均出现Ob-RbmRNA标记神经元,以梨状神经元层和颗粒层分布较密集。在延髓,下橄榄核、孤束核、迷走神经背核和舌下神经核出现Ob-RbmRNA标记神经元。Ob-RbmRNA主要位于胞质中,近核区密度较大。本文的结果与别人在啮齿类、人和猪上获得的结果基本一致,但也有一些差异,如本文在小脑皮质颗粒层、迷走神经背核、孤束核等均观察到Ob-Rb基因表达,人丘脑中有无Ob-Rb未见报道。这些结果的异同,既反映了Ob-Rb基因表达种系发生上的保守性,也反映存在种间差异,但也不排除实验方法的差异。本文结果进一步肯定了别人的研究结果,弥补了猪丘脑、小脑和延髓内Ob-RbmRNA核团分布定位资料的空白,为理解leptin的生理功能提供了形态学基础。3.3不同性能猪的ob-rbmrna的分布Leptin的表达和分泌,与体脂总量和脂肪细胞的大小高度相关,其血液浓度通常与体脂的含量成一定比例。长白三元杂交猪瘦肉率较高,体脂含量相对较低;梅山猪较肥,体脂含量相对较高。尽管本文未对长白猪与梅山猪丘脑、小脑和延髓内Ob-RbmRNA的分布定位做定量分析,但实验结果显示,在两者之间分布定位无明显的差异。其原因之一可能是2～3月龄的长白三元