替米考星hplc测定方法的改进

替米考星hplc测定方法的改进

氨基葡萄糖的化学名称为4a-o-脱（2、6-二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧化二氧基）。20世纪80年代，美国丽来公司用半合成泰乐菌素来生产大环内酯类动物。替米考星由顺式、反式和顺-8-差向异构3种异构体混合而成,分子式C46H80N2O13,相对分子质量869.15。替米考星对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、支原体、螺旋体等均有抑制作用。替米考星比泰乐菌素有更强的抗菌活性,临床用于由敏感菌引起的畜禽呼吸道感染,如家畜放线杆菌性胸膜肺炎、巴氏杆菌病、畜禽支原体病以及泌乳动物乳房炎的防治。另外,替米考星作为饲料添加剂连续使用14d可用于防治由放线杆菌和巴氏杆菌引起的猪细菌性肺炎。在替米考星含量测定中,美国药典采用梯度洗脱HPLC法,该方法费时、乙腈用量高、不易操作。我国《兽药质量标准》中替米考星的HPLC法不稳定,典型的表现有:顺式、反式替米考星峰的分离度不稳定;顺式峰有时有拖尾现象;在顺式替米考星的峰后有时会出现顺-8-差向异构体;反式峰的前面易出现杂峰。本文拟通过改变流动相的比例、稀释液pH值等,改进替米考星HPLC含量测定方法,通过考察溶液放置时间、光照等因素,确定减小顺-8-差向异构体峰面积的主要因素,为建立准确度高、精密度好的质量检测标准提供试验依据。1材料和方法1.1拜克公司的材料替米考星标准品(批号K0710305,含量90.3%)购自中国药品生物制品检定所;替米考星原料(批号08051501,含量85.5%)购自浙江升华拜克公司;乙腈(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)、磷酸二丁胺均为天津科密欧化学试剂有限公司产品;高效液相色谱仪、紫外检测器均为日本岛津产品;ODS柱色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为大连依利特公司生产;N2000色谱工作站为浙江大学智达信息工程有限公司产品。1.2溶液的制备1.2.1%磷酸溶液纯化·mL-1)的配制将10mL磷酸(体积分数为85%)缓慢地加到50mL纯化水中,定容至100mL,配制成10%磷酸溶液。将10%磷酸溶液70mL加到16.8mL二丁胺中,边加边搅拌,待溶液冷却至室温,用85%磷酸调节pH至2.5,加超纯水定容至100mL。1.2.2稀释剂的制备将5.7mL磷酸(85%)加入1000mL超纯水中,用100g·L-1的NaOH溶液调节pH至2.5,密封保存。1.2.3乙腈溶液的配制·mL-1)的配制精确称取25mg替米考星至50mL的容量瓶中,先加入10mL乙腈溶解,然后用稀释液定容至50mL,再以0.22μm有机滤膜过滤备用。1.3测试方法1.3.1条件1用十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料,检测波长280nm,流速1mL·min-1,柱温25℃,进样量20μL。1.3.2缓冲液和流动相的测定在1000mL流动相中,乙腈含量由115mL梯度降至110、105、100和80mL,四氢呋喃、磷酸盐(PBS)缓冲液均为50mL,其他为超纯水。流动相以0.45μm有机滤膜过滤,超声10min后使用。精确量取替米考星待测液20μL进样,分别用5种流动相检测,分析色谱峰和各项参数。1.3.3流动相ph按照乙腈、四氢呋喃、磷酸盐缓冲液、超纯水体积比为10∶5∶5∶80配制1000mL流动相,辅以100g·L-1NaOH溶液调节pH至2.75、2.68、2.50,以0.44μm有机滤膜过滤,超声10min,其他条件不变。精确量取替米考星待测液20μL进样,分别检测并分析各项参数。1.3.4ph值的确定将5.7mL磷酸加入到1000mL的超纯水中,配制4份,分别用100g·L-1NaOH溶液调节pH值,得到pH值为1.5、2.0、3.0、4.0的4种稀释液,密封保存备用。精确称取替米考星原料25mg4份分别置于50mL的容量瓶中,先加入10mL乙腈,再以配制好的不同pH值的稀释液进一步定容至50mL。以0.22μm有机滤膜过滤,进样,分别进行检测并分析各项参数,评价反式异构体和顺式异构体峰,计算所得回收率。1.3.5有机滤膜的制备精确称取替米考星原料25mg于50mL容量瓶中,首先加入10mL乙腈进行溶解,再以pH2.5稀释液定容至50mL。过0.22μm有机滤膜后分装至西林瓶中,置于光照条件下分别进行5d和10d的处理,同时设立避光组作为对照。进样,分别进行检测并分析各项参数,评价反式异构体和顺式异构体峰,计算所得回收率。1.3.6回收率、重复性试验加样回收试验:精确称取替米考星原料6份(各0.05g),置100mL容量瓶中,分别加入替米考星对照品0、10、20、25、30和50mg,加适量提取液使其溶解,并定容。按样品含量测定方法处理分析,计算加样回收率。重复性试验:配制3种浓度的替米考星对照品溶液(每1mL分别含替米考星0.3、0.5、0.8mg),分别进样,记录峰面积值,计算相对标准偏差。中间精密度试验:精确称取替米考星原料3份(各0.05g),按照试验中建立的方法,由不同操作者使用不同仪器、于不同时间测定并计算含量,计算相对标准偏差。1.4数据分析用统计软件SPSS17.0进行LSD方差分析和差异显著性检验,数据均以x¯±SEx¯±SE表示。2结果与分析2.1乙腈含量的影响试验结果(表1)显示,在1000mL流动相中乙腈含量分别为105、100和80mL的情况下,反式替米考星峰与顺式替米考星峰的分离度并无差异,但乙腈含量在115mL和110mL时其分离度差异极显著。乙腈含量为105mL的试验组与乙腈含量为110mL的试验组无显著差异,但与115mL组差异极显著。结果显示随着乙腈含量的升高,其分离度逐渐降低。顺式替米考星的拖尾因子在流动相中乙腈含量分别为80、105、100、110mL时差异极显著,而且随着乙腈含量的增加,拖尾因子有逐渐升高的趋势。顺式替米考星的理论塔板数在乙腈含量为100mL时最大,与其他试验组皆存在显著差异。由此可见,在每1000mL流动相中乙腈含量为100mL时,替米考星在HPLC测定中的各项参数达到最优状态。2.2流动相ph值对拖尾因子分离度的影响从流动相pH值对替米考星分离效果影响的试验结果(表2)可以看出,当流动相pH值为2.50和2.68时,反式替米考星峰与顺式替米考星峰的分离度没有差异,但在流动相pH值为2.50和2.68时,分离度都极显著大于pH2.75和2.80时分离度,且pH2.75和2.80时的分离度差异极显著;在拖尾因子参数中,流动相pH值为2.50、2.68、2.75和2.80时的拖尾因子值差异显著;在顺式峰理论塔板数中,流动相pH值为2.50和2.68时显著大于流动相pH值为2.75和2.80时的。由此可以确定,在流动相pH值为2.50时,替米考星原料在高效液相色谱法测定中的各项参数达到最优(图1)。2.3不同ph值对拖尾因子和顺式峰理论塔板数的影响表3显示,与对照相比,稀释液pH值为2.0和4.0时分离度无显著差异,但是pH值为1.5、2.0、3.0时分离度显著降低;稀释液pH值为1.5、2.0、2.5和3.0时拖尾因子与对照组相比差异显著或极显著,不过,稀释液pH值对顺式峰的理论塔板数无显著影响,对照组顺式峰的理论塔板数与pH值分别为1.5、2.0、3.0和4.0时无显著差异。分析稀释液pH值对替米考星回收率的影响发现,对照组替米考星回收率与稀释液pH值为1.5时无显著差异,但pH值为1.5时的回收率与pH值为2.0、2.5、4.0时存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01),且此时回收率最高。2.4光照对回收率的影响表4结果显示,对照组与避光5d组的分离度差异不显著,且光照5d组与避光5d组的分离度无显著差异,但对照组与光照5d组存在显著差异;光照5d组的拖尾因子与避光组和对照组差异显著,但对照组与避光5d组之间的拖尾因子无显著差异;光照5d组与避光5d组的顺式峰理论塔板数没有显著差异,但与对照组相比则差异显著;避光组与对照组的回收率无显著差异,但此两组与光照5d组的差异极显著,说明光照对反式替米考星含量分离度和反式替米考星的回收率影响很大,能明显降低顺式和反式替米考星的含量。光照10d组的分离度与避光10d组无显著差异,避光10d组与对照组的分离度存在显著差异,避光10d组与对照组差异不显著,以光照10d组的分离度为最大;光照10d组的顺式峰理论塔板数与对照组和避光10d组差异极显著,而对照组与避光组无显著差异;避光10d组与对照组的回收率无显著差异,而避光10d组与对照组的回收率均与光照10d组差异显著,而且极显著地高于光照10d组(表4)。从表4还可以看出,对照组的回收率极显著高于光照5d组和光照10d组,而光照5d组又显著高于光照10d组;对照组、避光5d组和避光10d组等3组间的回收率无显著差异。说明在避光条件下不影响反式替米考星和顺式替米考星的稳定性。2.5回收率和重复性实验采用优化后的色谱条件,加样回收试验结果(表5)显示,方法的相对标准偏差(RSD)为1.61%,说明此方法的回收率高,准确度好。重复性实验结果(表略)显示,0.3、0.5和0.8mg·mL-13种浓度梯度下替米考星的RSD值分别为1.17%、0.74%和1.15%,均小于2%,方法重现性好。分别由不同操作者使用不同仪器于不同时间条件下进行的中间精密度试验结果(表略)显示,本方法的中间精密度较好。3稀释液ph值的影响从本试验结果可以看出,每1000mL流动相中乙腈含量为100mL时,替米考星的顺、反式峰的分离度均为最高,而且随着乙腈含量的增加,其分离度逐渐降低,说明乙腈在流动相中所占的比例能反向地影响替米考星顺、反式峰的分离度。随着乙腈含量的增加,拖尾因子的值逐渐增大,而顺式替米考星峰理论塔板数逐渐降低。另外,随着流动相pH值的增加,参数中拖尾因子逐渐升高,而顺、反式异构体峰的分离度和顺式峰理论塔板数逐渐降低。说明常用的ODS柱虽然具有一定的pH值适用范围,