氧化苦参碱对rbl-2h3细胞分泌电池组和nf-的影响

氧化苦参碱对rbl-2h3细胞分泌电池组和nf-的影响

氧化苦参碱（oxy）是中药（如紫草）提取的重要活性成分。苦参是中医治疗变质尤其是i型变窄的常用药物。肥大细胞(MC)是I型变态反应速发相的主要靶细胞,也是I型变态反应性炎症的主要启动细胞。为探讨Oxy治疗变态反应性疾病的作用机制,我们观察了其对RBL-2H3肥大细胞活化分泌组胺和TNF-α的影响。1材料和方法1.1药品、试剂与检测试剂1640(Sigma),Hepes(Amresco),L-谷氨酰胺(武汉天远生物技术有限公司),标准新生小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),Oxy(标准品,购自武汉市药检所),色甘酸钠(Sigma),MTT(Amresco),Compound48/80(C48/80,深圳晶美),二甲基亚砜(DMSO,分析纯),台盼蓝(Sigma),胰蛋白酶(Amresco),大鼠TNF-αELISA检测试剂盒(深圳晶美),大鼠组胺ELISA检测试剂盒(DR.Lab.CaliforniaUSA),EDTA(分析纯)。1.2rbl-2h3细胞大鼠嗜碱性白血病细胞系(basophilicleukemiacellline)RBL-2H3细胞(第二军医大学全军临床免疫中心李莉博士赠)。1.3细胞培养实验RBL-2H3细胞在含10%血清的RPMI1640培养液,37℃,5%CO2条件下培养,3d传代1次。取对数生长的细胞,台盼蓝排斥染色活细胞率>95%,进行实验。用C48/80(终浓度为10μg/mL)诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒。1.4对oq值的检测实验步骤参照细胞培养1。RBL-2H3细胞密度为2×106/mL,Oxy起始浓度为3.2mg/mL,最后在酶标仪上检测OD490值,各组的吸光值均减掉未加细胞和药物的本底。检测结果按公式计算:细胞增殖抑制率=(1-加药细胞吸光值)/对照细胞吸光值×100%。1.5rb-2h3对rbl-3有影响(1)不加药物对rbl-2h3细胞tnf-表达的影响Oxy(终浓度为100、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL)5个剂量组,2个色甘酸钠(终浓度为0.1、0.5mg/mL)对照组,不加药物的作为阳性对照组,不加药物及C48/80作为空白对照组。根据预实验的结果,加入C48/80激发RBL-2H3细胞后,培养上清液中TNF-α的分泌在60min达高峰,组胺在30min达高峰,所以选择在RBL-2H3细胞激活60min及30min后检测培养上清液中TNF-α及组胺的分泌量。每组三个复孔,实验重复一次。(2)对天气形势法检测细胞外证据中各成分配的促进RBL-2H3细胞用0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA消化离心(1000r/min,5min),无钙无镁PBS轻轻洗涤细胞3次,用含钙离子3mM的RPMI1640调整细胞密度为1.5×106/mL,激发实验在Ep管内完成。每个Ep先加入200μL单细胞悬液,然后加入含钙离子3mM的RPMI1640培养液及Oxy及色甘酸钠至总体积300μL,阳性对照组及空白对照组加入相应量含钙离子3mM的RPMI1640培养液。预培养60min后加入C48/803μL进行激发,空白组加入含钙离子3mM的RPMI1640培养液。继续培养60min后冰浴终止反应,离心(4℃,1500r/min,5min)后取上清装入Ep管,作为检测TNF-α的标本。重复上述步骤,培养30min后冰浴终止反应,离心(4℃,1500r/min,5min)后取上清液作为检测细胞外组胺的标本,离心后的细胞加入300μLRPMI1640培养液混匀,反复冻融,离心(4℃,1500r/min,5min)后取上清作为检测细胞内组胺的标本。标本-20℃下保存。检测结果按公式计算:组胺释放率=[上清液中组胺浓度/(上清液中组胺浓度+细胞内组胺浓度)]×100%;组胺抑制率=[(阳性对照组组胺释放率-处理组上清液中组胺释放率-空白对照组组胺释放率)/(阳性对照组组胺释放率-空白对照组组胺释放率)]×100%;TNF-α抑制率=(阳性对照TNF-α浓度-处理组TNF-α浓度)/阳性对照TNF-α浓度×100%1.6检测组和tnf-i的试验用ELISA法检测组胺及TNF-α,严格按照试剂盒操作步骤进行。1.7统计方法实验数据用x¯±sx¯±s表示,SPSS11.5软件进行统计分析。2结果2.1胞增殖的稳定性Oxy高浓度时对RBL-2H3细胞增殖有抑制作用,低浓度时对RBL-2H3细胞的增殖有轻到中度刺激作用,并呈浓度依赖性,见图1。经CurveExpert1.3软件分析Oxy的IC50值为0.95mg/mL。因此,下一步实验中Oxy选取的5个浓度为100、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL。2.2rb-2h3细胞的活动过渡酶诱生组的结果是tnf-(1)rbl-2h3细胞激活前后各时间点者适应变量的关系经t检验,Oxy抑制激活的RBL-2H3细胞释放组胺作用不弱于色甘酸钠,见表1。经相关与回归分析RBL-2H3细胞激活后组胺释放抑制率与Oxy浓度的对数呈负相关,皮尔逊相关系数为-0.992(P=0.000<0.01),回归方程为Y=0.645-0.146(-lgX)(P=0.001<0.01),见图2。(2)tnf-激活的rbl-2h3细胞Oxy在100mg/mL对TNF-α释放的抑制率达(77.64±0.02)%。经t检验Oxy抑制激活的RBL-2H3细胞释放TNF-α作用不弱于色甘酸钠,见表2。经相关与回归分析,RBL-2H3细胞激活后释放TNF-α抑制率与Oxy浓度的对数呈负相关,皮尔逊相关系数为-0.976(P=0.000<0.01),回归方程为Y=4.160-4.965(-lgX)(P=0.005<0.01),见图3。3oxi与mc活化脱颗粒肥大细胞是I型变态反应的重要中介细胞和许多炎症反应后期的效应细胞,其在病理过程中的作用远超过其在过敏反应中作为效应细胞的作用2。组胺主要存在于MC和嗜碱粒细胞的颗粒中,是变态反应性皮肤病的重要致病介质,可以引起皮肤和黏膜毛细血管扩张、血管通透性增加;嗜酸粒细胞趋化作用3,4。MC既可预先形成TNF-α并贮存于其颗粒内,也可激活后新合成TNF-α并迅速大量释放5。MC分泌组胺及TNF-α的量均可反映MC活化及脱颗粒以及相关前炎症细胞因子的合成和分泌强度,是MC活化及脱颗粒的重要标志。RBL-2H3细胞是大鼠嗜碱性白血病细胞株的一个亚系,能模拟MC的多种功能,是体外研究与MC有关的各种生理、病理、药物作用机制等的重要模型6。抗原IgE复合物、C48/80等可通过不同途径活化RBL-2H3细胞,导致组胺、TNF-α、白介素等的释放7。苦参是中医治疗I型变态反应的常用药物,Oxy是中药苦参等提取的一种重要的喹诺里西啶类生物碱,可显著减轻小鼠哮喘模型病变组织中嗜酸粒细胞的浸润,抑制哮喘小鼠肺组织中IL-4mRNA的表达,具有抗气道变应性炎症的作用8。Oxy还可抑制迟发性变态反应,抑制同系细胞抗体介导的MC脱颗粒9。我们的实验表明:Oxy在较低浓度时即可抑制经C48/80激活的RBL-2H3细胞释放组胺和TNF-α,这种抑制作用不弱于色甘酸钠,且组胺、TNF-α释放的抑制率与Oxy浓度相关;与MTT的结果对照,Oxy的这种抑制作用与其抑制RBL-2H3细胞的增殖作用关系不大。殷金珠10等的研究表明Oxy能抑制IgE诱导的小鼠腹腔MC活化脱颗粒,认为Oxy的作用机制可能是提高细胞膜稳定性,影响细胞膜表面IgE受体桥联,从而