高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中青蒿素的药动学研究

高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中青蒿素的药动学研究

青艾酒是中国科学家在20世纪70年代发明的一种新结构的抗癫痫药物。自上市以来，这种药物在世界上挽救了数亿只疟疾患者的生命。它被称为抗癫痫药物发展史上的第三个里程碑，它被称为奎宁和氯仿后的第三个里程碑。青蒿素的发现,是中国科学家为人类拯救生命做出的重要贡献。由于这类药物与以往的抗疟药结构和作用机制完全不同,速效又安全,且与现有药物均无交叉抗药性,几十年来青蒿素类抗疟药一直是WHO关注的重点。青蒿素类药物由于化学结构的特殊性,一直没有理想的检测方法,为此,本研究建立了人体内青蒿素浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)的分析法,并将其用于中国健康志愿者体内的药代动力学研究。药品、试剂与仪器1药品、试剂与仪器青蒿素片,规格:每片250mg,批号:20051021-1,由昆明制药集团股份有限公司提供;青蒿素标准品,含量:99.0%,批号:100202-200402,中国生物制品药品检定所提供;内标:替米沙坦,含量:99.5%,批号:020801,北京致至医药科技发展有限公司提供。Q-TrapTM三重四极杆串联质谱仪,配有离子喷雾离子源以及Analyst1.3.2数据处理系统,美国AppliedBiosystem公司产品;1100高效液相色谱输液泵,美国Agilent公司产品。2入院前未服用其他药物2.1受试者选择健康男性受试者10人,年龄:(34.3±3.16)岁,身高:(1.67±0.06)m,体质量:(61.2±6.11)kg。试验前经全面体检,肝、肾功能、血、尿常规、心电图、血清学检查均正常。半月内未服用任何药物,3个月内未参加过其他药物试验者。试验前签署书面知情同意书。2.2分组、给药与服本研究为单剂开放试验设计,试验方案经中国人民解放军307医院伦理委员会批准。受试者药前禁食10h,给药剂量为1000mg(4片),温开水250mL1次口服;给药2h后方可饮水,4h后统一进低脂膳食。于给药前(0h)、给药后15、30、45min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24h,在肘静脉取血5mL,置肝素试管中,3000r·min-1离心10min,分离血浆,于-20℃保存备用。3质谱条件和检测方法3.1分析条件色谱ZorbaxextendC18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm,美国Agilent公司);流动相:甲醇-10mmol·L-1乙酸铵(80∶20);流量:1.2mL·min-1(分流体积比1∶1);柱温:40℃;进样量:10μL。质谱离子源:离子喷雾离子化源;离子喷射电压:5500V;温度:450℃;源内气体1(GS1,N2),压力:448.18kPa;气体2(GS2,N2),压力:448.18kPa;气帘气体(N2)压力:137.90kPa;正离子方式检测;扫描方式为多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)设置为Medium;青蒿素和内标替米沙坦的解簇电压(DP)分别为100、90V;碰撞能量(CE)分别为11、60eV;用于定量分析的离子反应分别为m/z283.3→m/z209.1和m/z515.20→m/z276.10。3.2在混合中添加乙烯-二氯甲烷固相液5.取血浆样品100μL置具塞试管中,加入内标溶液100μL(40μg·L-1替米沙坦),补加甲醇-水(50∶50)混合溶液100μL,混匀;加入乙醚-二氯甲烷(60∶40),涡流混合1min,往复振荡10min(每分240次),离心5min(15000r·min-1);取上层有机相于另一试管中,25℃氮气流下吹干,残留物加入流动相150μL立即溶解,涡流混合,进样10μL进行LC-MS-MS分析。4标准曲线范围4.1标准曲线制备在健康人空白血浆中,加入内标100μL及不同量的标准系列溶液100mL,使青蒿素浓度分别为4、10、30、100、300和1000μg·L-1。按样品处理与测定方法进行测定,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算,得回归方程:Y=7.81×10-4X+1.21×10-3,γ=0.9990。根据标准曲线,本方法的线性范围为4~1000μg·L-1;最低定量限为4μg·L-1。4.2准确度和精密度在空白人血浆中,加入不同量的标准系列溶液100mL,制备青蒿素低、中、高3个浓度(10、100、800μg·L-1)的质量控制(QC)样品,每浓度6样本,连续测定3天,根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,根据QC样品结果,计算本法的准确度与精密度。血样中,低、中、高日内变异分别为8.21%、4.07%、7.16%;日间变异分别为6.49%、4.58%、9.91%。方法学相对回收率分别为(93.3±9.81)%、(86.1±5.29)%、(89.2±3.50)%。4.3血浆青蒿素浓度检测依据“标准曲线”项下方法,制备稳定性QC样品,每一浓度测定3样本,经反复3次,于-20℃冰冻,室温溶解后,测定样品浓度。冻融后,测定血浆青蒿素浓度分别为(9.69±0.71)、(107.67±3.51)和(787.33±83.03)μg·L-1。所有冻融试验测定值与标示浓度的相对偏差(RE%)均<15%。4.4青蒿素和内标替米沙坦标准溶液的配制取空白血浆100mL,按“样品处理”项操作,得色谱图1A;将一定浓度的青蒿素和内标替米沙坦标准溶液加入空白血浆中,同法操作,得色谱图1B;取受试者给药后收集的血浆样品,同法操作,得色谱图1C。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰青蒿素和内标替米沙坦的测定。5auc0-的测量以梯形面积法计算AUC0-tn;Cmax、tmax为实测值。AUC0-∞=AUC0-tn+Ctn/ke;其他药代动力学参数采用中国药理学会数学药理委员会编制的3P97药代动力学程序软件计算。结果1血药浓度-时间曲线10名受试者空腹口服青蒿素片1000mg的平均血药浓度-时间曲线,见图2。2药房动态参数按统计处理方案,计算每个受试者的药代动力学参数,10名受试者空腹口服青蒿素片1000mg的平均药代动力学参数,见下表。质谱条件分析青蒿素类药物的化学结构中,缺少可利用的功能基团,本身只有紫外末端吸收,如用紫外吸收光谱法测定,结果不稳定。国外报道,主要采用高效液相n=10,mean±SD色谱法结合电化学检测器,在装置上要求比较严格。液相色谱-质谱联用技术,是20世纪70年代发展起来的将液相色谱分离技术与质谱检测手段结合。本实验建立了简单、快速、高灵敏度的高效液相色谱-串联质谱检测青蒿素的方法,并进行了人体内药代动力学的研究,该方法的标准曲线、最低定量限、精密度、准确度及稳定性均达到生物样品测定的要