猪血浆中替米考星的药物代谢动力学研究

猪血浆中替米考星的药物代谢动力学研究

氨基乙烯酸酯类抗生素是由含有糊精酸的酸水分析后的衍生物。这是一种半合成半合成抗生素。其具有特殊的抗菌活性和药动学特征,对所有的革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、支原体、螺旋体等均有抑制作用,尤其对胸膜肺炎放线杆菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和畜禽支原体具有非常强的灭菌活性。然而,替米考星不易溶于水,不管是口服还是注射都影响其使用效率。磷酸替米考星是替米考星与3,5-二甲基哌啶反应生成替米考星碱,再加磷酸和水反应后形成的,其易溶于水,具有特殊的抗菌活性和药代动力学特征,所以在兽医临床上可广泛应用于预防和治疗动物的感染性疾病。本试验中使用的磷酸替米考星与传统的替米考星相比,磷酸替米考星增加了化学基团,其化学结构发生变化,因此在动物体内的药代动力学也可能发生一定变化,而目前此类报道尚少。因此,为了拓宽替米考星的应用范围,笔者用磷酸化的替米考星可溶性粉给猪用药,以探讨磷酸替米考星在猪体内的药代动力学过程并阐明其药动学特征,旨在为家畜的合理用药提供科学依据。1材料和方法1.1试验材料1.1.1药物、药物枝力清、可溶性粉替米考星对照品(批号:k0310711,含量91.0%)购自中国兽药监察所;10%磷酸替米考星可溶性粉(批号:20110401,标示量为94.0%)由宁夏泰瑞制药股份有限公司提供;对照药物枝力清(10%替米考星可溶性粉,批号:11020601,标示量90.7%)由瑞普(天津)生物药业有限公司提供;磷酸(分析纯)、乙酸铵(分析纯)为国药集团化学试剂有限公司产品;乙腈(色谱纯)为德国Merck公司产品;甲醇(色谱纯)为江苏汉邦科技公司产品;四氢呋喃(色谱纯)为美国TEDIA公司产品。1.1.2试验饲料及给料32头健康姜曲海品种猪,体质量约(25±2)kg,雌雄各半,饲养于单独的代谢笼中,自由饮水,试验开始前及试验过程中饲喂不含任何抗生素的全价饲料,每天定时给料2次。试验前先给猪打耳标,逐头称质量并记录,连续饲喂3周以适应养殖环境。1.1.3仪器、仪器和萃取高效液相色谱仪(LC-2010)为日本岛津公司产品;色谱柱(XTerraue4d2RP18,4.6mm×50mm,5μm)为美国Waters公司产品;SPE柱(BondElμt,C18,100mg·mL-1)为美国Agilent公司产品;台式离心机(LD4-2A)为北京京立离心机有限公司产品;旋涡混合仪(WH-2型)为上海沪西分析仪器有限公司产品;微量分析天平(FA1004N,精确度0.0001g)为德国莎多利斯公司产品;pH计(pH221)为意大利HANNA公司产品;固相萃取真空管装置为天津市东康科技有限公司产品;溶剂过滤器为天津市奥特塞恩斯仪器有限公司产品;针筒式微孔滤膜过滤器(孔径0.22μm)为江苏汉邦科技公司产品。1.1.4标准溶液制备1.2测试方法1.2.1色谱柱及反相色谱柱检测器:光二级管阵列检测器(PDA);检测波长280nm;色谱柱:Inertsil,ODS反相色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相乙腈-四氢呋喃-二丁胺-磷酸缓冲液(体积比为10∶5∶5∶80);流速1.0mL·min-1。1.2.2标准工作溶液的hplc分析用流动相将替米考星标准储备液分别稀释成0.05、0.5、1、5、10和25μg·mL-1的标准工作溶液,各取10μL进行HPLC分析。以浓度为横坐标,峰面积(顺式和反式异构体的峰面积之和)为纵坐标,绘制标准曲线。1.2.3单次注射磷酸替米考星可溶性粉1次灌装液见表1试验分为2组,第1组为10%磷酸替米考星可溶性粉静脉注射组,8头猪,5mg·kg-1的10%磷酸替米考星可溶性粉1次静脉注射;第2组为10%磷酸替米考星可溶性粉口服组,6头猪,120mg·L-1(9.6mg·kg-1)的10%磷酸替米考星可溶性粉1次灌服。通过预试验,确定口服喂药后的采血点分别在0.08、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、72和96h;注射给药后分别在0.08、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36和48h采血。所有受试猪给药后,分别于前腔静脉各采血10mL,置于含有肝素的聚丙烯离心管中,3500r·min-1离心10min,吸取上层血浆置于聚丙烯离心管中,密封,避光,-20℃保存备用。1.2.4u3000酸、碱分别吹脱、干燥将SPE柱置于固相萃取真空管装置上,10mL甲醇活化和10mL水平衡SPE柱。精确量取血浆样品2mL上样,让样品通过SPE柱,调整真空泵的压力使流速为约每秒1滴,10mL纯水和12mL乙腈-水(体积比为35∶65)分别洗涤。溶液从SPE柱流出后,将真空泵的压力调小,让SPE柱在真空下干燥至少5min,利用2.5mL洗脱液洗脱于刻度试管中,30℃水浴中氮气吹至近干。用流动相溶解定容至1mL,涡旋30s,静置15min,0.22μm针筒式滤膜过滤后取10μL进行HPLC分析。1.2.5检测限和定量限取空白(未给药)血浆样品,添加标样,采用倍比稀释,按上述样品前处理方法进行处理,测定色谱系统的基线噪音值,按信号强度与噪声强度比(S/N)为3作为检测限(LOD),S/N=10为定量限(LOQ)。1.2.6样品前处理取血浆2.0mL,添加一定体积的储备液,使血浆中药物质量浓度为0.05、0.50和5.00μg·mL-1,按上述样品前处理方法分别处理后进行HPLC测定。一日内每个浓度取3个平行样品,分别测定并计算回收率和日内变异系数。1.3生物利用度计算方法药时数据采用中国药理学会数学专业委员会编制的3p97药代动力学程序软件进行曲线拟合,采用Marquardt法对一、二、三房室分别取权重1、1/C、1/C2进行计算。根据残差平方和(WSS)最小及拟合度(r2)最大判断最适药代动力学模型。绝对生物利用度(F)计算公式如下:式中,AUC口服和AUC静注分别表示口服和静注给药组血药浓度-时间(药时)曲线下面积;D静注和D口服分别为静注组和口服组的药物剂量。2结果与分析2.1替米考星浓度计算在药物浓度0.05~25μg·mL-1范围内,替米考星峰面积(顺式和反式异构体的峰面积之和)与浓度呈线性相关,得到其回归方程是Y=14192x-1035(R2=0.9998)。结果显示,替米考星峰面积与浓度呈完全正相关,通过此方程求得的替米考星的浓度较为精准。因为该标准曲线的浓度范围较大,如果样品的浓度较低(高)可采用低(高)浓度的标准工作溶液分别绘制标准曲线,可减少分析误差。2.2替米考星的mde取空白(未给药)血浆样品,添加标样,倍比稀释及处理后,求得血浆中替米考星浓度的LOQ和LOD分别为0.05和0.025μg·mL-1。结果如图1所示。2.3物提取的回收率如表1所示,当替米考星为0.01、0.1和1.0μg·mL-1时,猪血浆中药物提取的平均回收率分别为86.5%、84.1%和82.6%,变异系数为1.0%~11.7%。该猪血浆处理方法和检测方法可靠,重复性好,回收率和变异系数都达到了兽用化学药物药代动力学试验指导原则的要求,能满足用于磷酸替米考星在动物血浆中的检测。2.4代动力学参数结果受试猪口服和静注一定剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉和对照药10%替米考星可溶性粉后,其血药浓度、药代动力学参数结果如表2、图2和图3所示。磷酸替米考星经猪口服后,其吸收半衰期和分布半衰期分别为(1.5528±0.2951)h和(2.1902±0.6712)h。给猪口服和注射10%磷酸替米考星可溶性粉后,药物在猪体内吸收、分布很快,消除较为缓慢,血药浓度-时间数据符合二室开放模型。2.5绝对生物利用根据绝对生物利用度(F)公式计算可知,磷酸替米考星绝对生物利用度为89.19%。3生物利用度试验磷酸替米考星可溶性粉经静脉注射后,药物在猪体内吸收、分布很快,消除较慢,符合二室开放模型,这种药代动力学特征与替米考星在猪体内经静脉注射后相似。磷酸替米考星分布半衰期和消除半衰期分别为(0.1446±0.0952)h和(11.2861±9.3751)h,消除半衰期远远大于分布半衰期。中央室表观分布容积(Vd)为(6.2266±2.7232)L·kg-1,大于1L·kg-1,这说明磷酸替米考星与替米考星一样,在猪体内组织穿透力强,组织分布广泛。据报道给猪口服50mg·kg-1替米考星后其T1/2α、T1/2ka分别为(1.90±0.64)h和(3.35±1.11)h,与本试验结果基本一致。从口服组试验结果可以看出,给猪口服10%磷酸替米考星可溶性粉后,药物在猪体内吸收、分布很快,消除较为缓慢,血药浓度-时间数据符合二室开放模型,这种药代动力学特征与猪口服替米考星后体内药代动力学特征相似。10%磷酸替米考星可溶性粉口服后血药浓度-时间曲线下面积(AUC)为(5.2498±1.1778)μg·h·mL-1,磷酸替米考星可溶性粉(5.0mg·kg-1)静注后药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为(3.065