大鼠脑内功能神经元分布的实验研究

大鼠脑内功能神经元分布的实验研究

越来越多的研究表明，网络系统不是一个唯一的调节系统，而是与中枢神经系统之间的双向关系。然而，是否应该解决中枢神经系统中某些部位的参与免疫调节问题。早期即刻基因被认为是神经元激活的标志,c-fos的表达产物包括Fos及其相关蛋白可作为转录因子,促进靶基因的转录,在细胞的信号转导中起着重要的作用。外界的多种刺激,包括免疫性刺激均可诱导Fos在中枢的表达。近年来,c-fos诱导及显示技术在神经系统形态和功能相结合的研究中受到了广泛的应用。本实验以脂多糖(LPS)作为免疫激发剂来模拟免疫激发状态,利用免疫组织化学方法显示并观察Fos蛋白在脑内的分布,为明确与免疫应答相关的中枢神经系统结构提供一些线索。材料和方法1.饲养环境成年SD大鼠10只,体重250~350g,安静、温暖(20℃)、避强光的环境中饲养48h。随机分为实验组(n=6)和对照组(n=4)。2.试验组2.1动物的组织固定乙醚吸入麻醉后,经腹腔注射300μl生理盐水溶解的LPS100μg(Sigma,0127∶B8),动物存活3h后用1%戊巴比妥钠深麻,开胸经左心室至升主动脉插管,先以100ml生理盐水冲洗血液,随后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)灌流固定。灌毕取全脑置于含30%蔗糖的0.1mol/LPB内(4℃)至组织块沉底。冰冻连续冠状切片,片厚30μm。2.2生物素标记-卵白素-hrp混合物面色切片入含0.3%TritonX-100处理后,按ABC法先进行抗Fos免疫组织化学反应。依次孵育于:(1)兔抗Fos抗体稀释液(1∶3000,SantaCruz)24h(4℃);(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)2h(室温);(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC,1∶500,Sigma)2h(室温)。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min。最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法呈色。然后常规裱片、脱水、透明、DPX封固、光镜观察。3.对照组3.1麻醉试验n.2正常大鼠经乙醚吸入麻醉,3h后戊巴比妥钠深麻处死,灌流固定取材同前,切片按ABC法进行Fos免疫组织化学染色。3.2生理盐水比较试验n.2正常大鼠乙醚吸入麻醉后经腹腔注入300μl生理盐水,存活3h后戊巴比妥钠深麻处死。切片按ABC法进行Fos免疫组织化学染色。3.3免疫组织化学染色的替代试验取实验组大鼠部分大脑切片,用0.01mol/LPBS代替兔抗Fos第一抗体,再按ABC法进行免疫组织化学染色。结果1.试验组1.1梨状皮质的分布额顶皮质和扣带皮质有较密集的Fos阳性分布。梨状皮质(图1)、外侧隔核腹侧部、中央杏仁核(图2)、斜角带核及终板血管器内有中等密度的分布(图3)。其他皮质及核团分布均稀少。1.2脑室旁核和丘脑旁核下丘脑和丘脑区域Fos阳性产物主要密集分布于下丘脑室旁核(图4)和丘脑室旁核(图5),弓状核、视上核(图6)、视交叉上核和下丘脑外侧区等有中等密度的分布,外侧缰核和正中隆起内亦可见到少许Fos表达。1.3脑瘫小脑内无明显Fos分布密集区。1.4延髓腹外侧后fos分布中脑导水管周围灰质腹外侧部及外侧臂旁核内有中等密度的Fos阳性分布,脑桥核、上丘、前庭内侧核和蜗神经核内也有少量的Fos阳性分布。Fos阳性细胞在延髓的分布极具规律性,主要密集分布于中、尾段延髓,多为深染,两侧呈对称性分布。集中分布于延髓背内侧部(DMM),其次分布于延髓腹外侧区(VLM)及位于两者之间的中间网状带(IRt)内,三者形成了一条背内-腹外方向伸展的弧形带状区——延髓内脏带。Fos阳性细胞在DMM内主要分布于弧束核联合亚核、内侧亚核和最后区(图7),VLM内主要位于腹外侧网状核(图8),在IRt则主要集中于其内侧部。此外,三叉神经脊束核、外侧楔核和下橄榄核等也有少量的Fos分布。上述各部脑区及核团内Fos阳性细胞的分布详见图9。2.浅染分布分布2.1麻醉及生理盐水对照组大鼠脑内仅有散在的Fos分布,多为浅染且数量很少,无明显密集分布区。2.2免疫组织化学染色替代实验的切片反应呈阴性。神经免疫调节众所周知,动物和人体内存在着神经-免疫调节网络,近10年来,关于神经系统和免疫系统之间关系的研究是目前国内外学术界的研究热点之一。由于此项工作尚处于起步阶段,对于中枢神经系统参与免疫应答的具体部位,仍不甚清楚。LPS是革兰阴性杆菌的细胞壁成分,能够刺激免疫细胞分泌白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等多种细胞因子,在免疫应答研究中常被作为一种多克隆免疫激发剂来模拟机体免疫激发状态。多数学者认为LPS引起的和神经活动有关的中枢效应主要是由IL-1为主的细胞因子介导的。当机体受到某种刺激(如伤害性刺激、免疫刺激等)时,在该刺激信息向中枢传导的神经通路上,多数神经元均会出现Fos蛋白阳性表达,用免疫组织化学方法可以将其显示出来。Fos蛋白形态学显示方法的建立也为研究免疫刺激信息的传导通路提供了一个快捷、敏感和方便的研究手段。虽然结果是通过形态学方法显示,但在某种程度上反映了一定的功能意义,因此是一种形态学和功能学相结合的指标。多种刺激均可引起Fos蛋白阳性表达,而且在一定条件下胶质细胞也会有反应。但在严格控制实验条件的前提下,Fos显示方法仍是一种非常方便和分辨率很高的方法。因此,实验中我们轻柔抓取动物,尽量避免外界非特异性刺激(强光和噪音等),同时采取乙醚诱导麻醉,以防止在给药过程中动物的挣扎反应,并进行严格的对照实验,保证了结果的特异性。在神经免疫调节的研究中,常将下丘脑作为焦点。Ju等认为下丘脑PVN(特别是其前大细胞亚核)是免疫应答的一个重要整合中枢。经侧脑室途径给予LPS,亦可以兴奋下丘脑PVN、视上核和边缘结构等区域,表现为出现Fos阳性表达。本实验中我们观察到腹腔给予LPS主要激活以下脑区:大脑皮层(额顶皮质)、边缘前脑(扣带皮质、梨状皮质、隔核和杏仁核等)、丘脑和下丘脑、脑干和室周器官(终板血管器、正中隆起、最后区等),与以往的实验结果基本一致,说明上述部位与神经免疫调节密切相关。1990年饶志仁等研究发现,大鼠延髓中尾段存在一条从背内侧经中间网状结构至腹外侧的弧形带状区,与内脏活动(心血管、呼吸和胃肠活动等)有密切关系,因此提出了延髓内脏带(medullaryvisceralzone,MVZ)这一新的概念,并已被国际学术界认可。MVZ包括延髓背内侧的弧束核(NTS)、迷走神经背运动核(dmnX)及最后区(AP)、腹外侧的疑核(nA)、外侧网状核(LRt)及腹外侧网状核(VLRt)和两者之间的中间网状带。延髓生命中枢位于MVZ内。值得注意的是,实验结果显示MVZ内对LPS免疫刺激起反应的神经元主要位于其内侧部,说明MVZ内侧部与神经免疫调节的调控相关。MVZ作为一独特的机能结构区,有着复杂而重要的功能。它是内脏感觉传递中继站,参与躯体-内脏感觉的会聚。MVZ与前脑边缘系(中央杏仁核、终纹床核等)、下丘脑和丘脑等之间存在直接的往返环路和通过外侧臂旁核和中脑中央灰质的间接环路,这些传导通路可能与免疫反应的调控有关。本文图1~8见插图第2页图版说明图1大脑梨状皮质内Fos阳性细胞×40图2中央杏仁核内Fos阳性细胞×80图3斜角带核(DB)及终板血管器(VOLT)内Fos阳性细胞×80图4下丘脑室旁核内Fos阳性细胞×80图5丘脑室旁核(PV)内Fos阳性细胞×40图6视上核内Fos阳性细胞×40图7延髓内脏带(MVZ)背内侧部(DMM)内Fos阳性细胞(AP.最后区,NTS.孤束核)×40图8MVZ腹外侧部(VLM)内Fos阳性细胞×40ExplanationoffiguresFig.1Fospositiveneuronsinthepiriformcortex.×40Fig.2Fospositiveneuronsinthecentralamygdaloidnucleus.×80Fig.3Fospositiveneuronsinthediagonalbandnucleus(DB)andvascularorganoflaminaterm(VOLT).×80Fig.4Fospositiveneuronsinthehypothalamicparaventricularnucleus.×80Fig.5Fospositiveneuronsintheparaventricularthalamicnucleus(PV).×40Fig.6Fospositiveneuronsinthesupraopticnucleus.×40Fig.7Fosposi