大鼠下丘脑视上核内一氧化氮合酶和雌激素受体的分布

大鼠下丘脑视上核内一氧化氮合酶和雌激素受体的分布

雌花是近年来研究较多的神经类固醇激素。它的合成和释放受到基底和垂体-腺体轴的控制。雌激素受体(ER)在下丘脑分布较广,主要分布于视上核、室旁核、视前区和腹内侧核等核团,雌激素通过与其受体结合,参与和介导了下丘脑内的诸多功能。如对下丘脑-垂体-性腺轴的调控以及下丘脑内神经肽的表达和调控。雌激素与神经营养因子一样,在促进神经元的分化、存活、保护神经元、维持神经元正常功能等方面起重要作用。一氧化氮(NO)是脑内的重要信使,由一氧化氮合酶(NOS)合成,是一种气体信息递质。NOS阳性神经元的胞体和突起广泛分布于整个下丘脑,集中分布于视上核、室旁核、下丘脑外侧区和弓状核等区域。NO和雌激素一样都介导和参与了下丘脑的许多重要功能。如NO介导和调控催产素(OT)和加压素(VP)、促性腺激素释放激素(GnRh)的释放,及其他神经递质的释放,并参与突触可塑性的形成。由于NOS与ER在分布上有共性区域,二者在视上核、室旁核均有表达,另一方面从功能上来看二者也有一定联系,因此我们设计采用NADPH-d组织化学法和免疫组织化学技术相结合的方法对下丘脑视上核内NOS和ER共存进行形态学的观察和研究,以期为进一步探讨NO与雌激素之间的内在联系提供形态学的依据。1材料和方法1.1饲养动物中心采用SD雌性大鼠30只(山西医科大学实验动物中心提供),体重220-260g,将动物置于温暖,安静,避强光环境下饲养,使之适应周围环境保持基础状态。1.2试剂和试剂盒雌激素受体(ER)购自武汉博士德生物工程有限公司,硝基四氮唑蓝(NBT)购自上海生工生物工程技术服务有限公司,还原型辅酶Ⅱ-黄递酶(NADPH-d)购自华美生物工程公司,SABC试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3灌注pbs液大鼠麻醉后,经左心室升主动脉依次灌入生理盐水、4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)、10%的蔗糖PBS液,灌注后取脑,入4%的多聚甲醛液后固定3h,然后入20%的蔗糖PBS液(4℃)冰箱过夜。待脑组织浸泡沉底后取出,截取下丘脑部分脑组织,做冠状面连续冰冻切片,隔3取1,片厚约40μm。1.4染色将切片分成3套,一套行NADPH-d组织化学染色,一套行ER免疫组化染色,另一套行NADPH-d/ER双重染色。1.4.1羊抗兔igg片图1将经山羊血清孵育过的切片放入浓缩型兔抗ER血清(1∶100PBS稀释)中37℃恒温箱孵育3h,后置4℃冰箱过夜,入生物素标记的羊抗兔IgG液(即用型)中,37℃恒温箱孵育0.5h,入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃恒温箱孵育0.5h,PBS液漂洗3次,DAB显色后裱片制片。1.4.2-ndh-d-nadph-d将切片在0.01mol/L的PBS液漂洗3次后,入孵育液37℃恒温箱孵育1.5h,孵育液组成包括:0.3%Tritonx-100,1mg/mlβ-NADPH-d,0.5mg/mlNBT的PBS缓冲液,用PBS缓冲液(pH7.4)终止反应后,裱片制片。1.4.3正常羊血清学组pbs在NADPH-d染色的基础上再行ER免疫组化染色,用0.01mol/L的PBS液(pH7.4),漂洗3次,入正常山羊血清37℃孵育1h;以后步骤同ER免疫组化染色程序。1.5比较试验另取一只鼠脑冠状连续切片分4组分别作以下反应。1.5.1抗感染试验①空白试验:分别省去两套染色中的NADPH-d、兔抗ER血清,分别孵育切片。②置换试验:用正常兔血清代替兔抗ER血清。1.5.2dab/双氧水呈色在行NADPH-d组织化学染色后,切片经PBS液漂洗,直接进行ER免疫组化染色中的DAB/双氧水呈色步骤,证实是否有残余的NADPH-d、NBT与DAB反应而导致反应产物混杂。1.6mpusbl2显微检测先于明视野显微镜下对各切片逐一观察,后用OlympusC-5050ZOOM数码相机在OlympusBH2显微镜下摄片。每只动物选片5张,每张切片测4个视野,在捷达801形态图像分析系统下进行图像分析,分别计数下丘脑视上核内NOS阳性神经元数目,ER阳性神经元数目及NOS/ER双染神经元数目和测量其各自神经元截面直径,并计算出双染神经元数占所有神经元的百分比。2结果2.1nos阳性神经元NOS阳性神经元在视上核内分布广泛,呈内侧稍宽的带状分布于视交叉的外上部,大部分集中分布在视上核的背内侧部和背外侧部。视上核NOS阳性神经元密集成团簇状,NOS阳性神经元呈蓝色或蓝黑色,细胞核不着色,胞质着色,胞体上发出的突起清晰可见,胞体和树突的极性与核团长轴平行。NOS阳性神经元以梭形或椭圆形细胞多见,胞体较大,胞质着色较深,胞核透亮,可见到突起交织成丛和“串珠”样外观。细胞以大细胞为主,偶见小细胞型,直径多在15-20μm(图1,2,见封3)。2.2外侧部er阳性神经元/类型分布ER阳性神经元在视上核的表达不及NOS阳性神经元广泛,集中分布于视上核的外侧部,视上核的ER阳性神经元呈棕黄色,胞核着色较深,胞质着色不明显。ER阳性神经元多呈卵圆形,突起不明显,偶可见较短突起。少数细胞着色较深,绝大多数着色较浅,但细胞轮廓清晰,分布较密集(图3,见封3)。2.3nos及er双染阳性神经元形态观察下丘脑区NOS及ER双染阳性神经元分布广泛,多见于视上核、室旁核、下丘脑外侧区等部,其中视上核NOS及ER双染阳性神经元表达最强,分布最广。在视上核,低倍镜下可见蓝染的NOS阳性神经元和散在其中的淡染的呈棕黄色的ER阳性神经元以及大量的双染阳性神经元。NOS和ER双染神经元胞质呈蓝色,胞核呈棕黄色。高倍镜下,NOS神经元着色深,呈蓝或蓝黑色,密集成簇,胞体上发出的突起清晰可见。少数细胞突起较长,直径较粗,多伸向视交叉腹侧,与远端的双染神经元突起交织在一起,可见明显的“串珠”样外观。ER神经元着色淡,多散在分布,胞体多呈梭形或椭圆形,可见到有突起发出,但数目不多,偶可见到突起相互交织。双染神经元胞核呈棕黄色,有的透亮,胞质蓝染,细胞多呈梭形或椭圆形,突起明显,呈“串珠”样外观。在少数双染的阳性神经元中,还可见到胞核内深染的核仁。视上核双染神经元胞体较大,直径达20μm左右,多为大细胞型神经元。NOS及ER双染阳性神经元多位于视上核的背外侧和背内侧部。在视上核内双染神经元占70%-80%(图4,见封3)。对照试验分别省去NADPH-d和兔抗ER血清,不出现相应的染色阳性结果。用正常的兔血清代替兔抗ER血清,也不出现阳性免疫反应,表明本实验无抗体交叉反应存在。呈色混合试验阴性,表明两套反应程序之间互相不干扰,具有一定的特异性。3讨论3.1no、no的诱导国内外资料显示,雌激素在中枢和外周神经系统有一个广泛的生理学效应,如调节神经内分泌活动,机体自律活动调节,神经保护效应及提高认识活动等,这些效应都是通过NO介导和影响的。妇女绝经后冠心病用E2治疗后,NOSⅢ在血管内皮表达增高,在脑内许多区域可见NOS表达增多,在海马神经元中,NO介导了E2诱导神经突触的产生。在去势的大鼠体内已经证实了E2对因生理压力应激引起的血压增高有削弱作用,这个影响是由脑内的NO介导的。所有这些资料表明,NO在雌激素对神经组织的作用上是一个很重要的介质。研究进一步发现,在人的SK-N-SH细胞体外培养中证实E2能诱导NO产生,并且E2是通过活化cNOS(即nNOS和eNOS特定组成合酶)而产生NO的,这个过程受细胞内外Ca2+调控。上述实验为NO介导雌激素作用提供了强有力的证据。即NO是雌激素作用ER后,产生的第二信使,介导和完成了雌激素的作用。本实验中发现在下丘脑视上核可见NOS与ER双染神经元,使得NO介导雌激素受体的作用在形态学上得到了证明。3.2er和vp神经元的调控本实验发现视上核和室旁核均有NOS与ER双染的神经元,且表达较强。视上核的双染神经元多分布在背内侧和背外侧部。视上核的神经元可分为大细胞和小细胞两种分泌神经元。视上核主要以大细胞分泌神经元为主,主要分泌催产素(OT)和加压素(VP)。国外研究表明NOS与VP和OT神经元分布有共存。在成年大鼠下丘脑神经垂体系统中NOS可与加压素及催产素共存,NO能调节VP和OT的释放,NO是由视上核和室旁核大细胞型神经分泌细胞的功能活跃增加而产生的。在等渗、有效循环血量正常时,NO抑制OT和VP的分泌;当失血、脱水、血容量减少时,NO对VP神经元抑制作用减弱,而对OT神经元的抑制却加强了。其作用机制是优先释放VP,对抗或更正身体水分的失衡。在去势大鼠,45%-98%的OT与88%-99%的VP神经元含有ERβ(雌激素β受体),ERβ和VP神经元共存于视上核背外侧部,在室旁核ERβ和VP共存于大细胞后外侧区。ERβ与OT神经元虽也有双标,但在室旁核(PVN)和视上核(SON)都较少,主要是在PVN内。在高渗状态下ERβmRNA表达下降,同时ERβ也下降,证明ERβ对渗透压改变呈负相关。可以看出,NO和ER对OT和VP的分泌都起到了调控的作用,二者对VP的调节都呈负向的调节。ER在受高渗刺激时,它表达减弱,而NO在等渗状态时抑制VP和OT释放。有报道表明,睾酮、双氢睾酮、皮质醇同样可以抑制因渗透压改变引起的VP释放,类固醇激素对因渗透压改变引起的VP释放的抑制作用很可能是通过兴奋性氨基酸(谷氨酸)来介导完成的。NOS与谷氨酸受体在下丘脑神经垂体轴及室周器分布广泛,γ-氨基丁酸对大细胞型神经分泌细胞的神经支配在此处也较广。其机制为谷氨酸通过与N-methyl-D-aspartate(NMDA)型谷氨酸受体结合后使NO释放,进而使γ-氨基丁酸能神经元活性增加,抑制大细胞型神经分泌细胞分泌OT和VP。结合本实验结果,ER与NOS神经元在PVN和SON共存,主要分布在SON的背内侧、背外侧部,在此处的大细胞分泌OT和VP神经元。所以,我们有理由相信ER对OT和VP的调节是通过NO来实现的。此外,从雌激素本身的意义来看,女性进入绝经期后,伴随着体内雌激素水平的下降,患各种疾病的风险增加。绝经后女性易患心血管疾病、高血压、冠心病、骨质疏松,以及神经退行性疾病等,由此可以看出雌激素对预防和减少这类疾病的发生有重要意义。另一方面雌激素在对上述疾病发挥其保护作用恰恰又是通过NO实现的,