维生素d受体敲除小鼠肾脏组织及血浆肾素表达的研究

维生素d受体敲除小鼠肾脏组织及血浆肾素表达的研究

维生素d（vd）是一种脂肪性维生素，其活性物质为1,25（h）d23。在皮肤辐射下，7-脱氢胆固醇可转化为维生素d，然后通过肝脏25-羟色胺酶活性转化为25-（h）3。最后，它被转化为1,25，2o和其他生物活性物质。VDR(vitaminDreceptor)是VD核受体,广泛存在于各种组织和器官中,与活化的1,25(OH)2D3结合,发挥多种生物功能。过去认为主要是调节水盐、骨钙代谢等。近十几年研究表明VD通过其受体不仅调控脂肪细胞的发生、脂代谢、糖代谢、免疫系统,还通过调节肾素-血管紧张素系统对心血管、肾、脑及动物的行为等功能进行调控。近年来研究显示在感染时还能够调节肠上皮细胞间的紧密连接。由于VD能够增加血钙,限制了临床应用,而VD类似物的分子结构与VD相似,很少有升高血钙的作用,具有广阔应用前景。肾素(renin)血管紧张素系统(angiotensinII,RAS)是人体内重要的体液调节系统,广泛存在于血管壁、心脏、中枢、肾脏和肾上腺等组织中,参与靶器官的调节,对心血管系统的正常发育、心血管功能稳态、电解质和体液平衡的维持以及血压的调节均有重要作用。传统的观念认为,循环系统中肾素主要来自肾脏,近十几年来随着分子生物学技术的广泛应用,发现在心肌、血管平滑肌、骨骼肌、脑、肾、性腺等多种器官组织中均有肾素及血管紧张素原的基因表达。VD通过抑制肾素-血管紧张素系统的活性直接调节人体的血压,动物试验表明VD对RAS系统具有负性调节作用。国内关于VD对肾素系统调节作用的研究很少,本研究对比VD受体敲除(VDR)鼠和野生正常鼠的肾脏、心、脑、结肠组织及血浆中的肾素水平的表达不同,探讨VD对不同器官肾素的调节作用,为进一步实验奠定基础。1材料和方法1.1鼠、大鼠、动物C57BL/6源性野生鼠和维生素D受体(VDR)敲除鼠,2月龄,体质量20~25g,室温饲养,普通饲料,自由饮水、进食。将动物分为野生组和VDR敲除组,脱颈处死后取肾脏组织、脑组织、心脏组织、结肠组织及血液。1.2抗体内部感染将野生鼠和VDR敲除鼠的肾脏、心脏和脑组织用4%多聚甲醛固定过夜;梯度酒精脱水;二甲苯透明;浸蜡;石蜡包埋后切片;60℃烘烤过夜;脱蜡;4℃孵育一抗过夜,抗体稀释浓度(1:100);PBS洗3次,每次5min;荧光二抗室温孵育2h(避光);PBS洗3次,每次5min;梯度酒精脱水,二甲苯透明后封片;用荧光显微镜观察、照相。1.3特异性引物的制备将动物组织提出后,用Trizol法提取RNA;用invitrogen公司的逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA;使用Primer3.0设计合成特异性引物,引物序列为AAGAAGGCTGTGCGGTAGTGGT,TCCTGTT-GGGATACTGTAGCACGT;用invitrogen公司的realtimePCR试剂盒及realtimePCR仪将目的cDNA按上述引物序列进行扩增检测。1.4血管紧张肽原酶蛋白分子检测提取动物血浆,肝素抗凝,按文献中的方法测定血浆中肾素活性。应用全自动化学发光免疫分析仪,直接检测血清中的血管紧张肽原酶蛋白质分子。测量时注意转换因子为11.2,即在ng/ml单位下的11.2倍的血浆肾素活性相当于直接肾素在mcU/ml单位上的测量。1.5统计处理采用SPSS11.0软件,用One-WayANOVA进行差异比较分析,P<0.05为具有显著性差异。2结果2.1vdr敲除鼠肾素表达情况用免疫荧光法染色,VDR敲除鼠肾脏JG细胞中强烈表达肾素(图1-B箭头处),与野生鼠比较(图1-A),VDR敲除鼠的JG细胞中肾素表达水平明显增加。实时PCR法测定结果显示:VDR敲除鼠(ko)肾脏的肾素在肾脏中的Ct值明显高于野生鼠(wt),两者有统计学意义(P<0.005,图1-C)。表明VDR缺失使肾素表达增强,抑制了肾素在肾脏中的表达。2.2vdr在心脏血管内皮表达阳性的情况见表2从图2可以看出,肾素在VDR敲除鼠心脏血管中表达强阳性(图2-B中箭头处),该结果说明缺少VDR的实验鼠肾素系统异常激活,提示VDR可以抑制肾素在心脏血管内皮中的表达。2.3猪脑室旁核肾素表达水平野生鼠脑组织经免疫荧光法染色后,其肾素在脑室旁核表达显示:VDR敲除鼠肾素在脑室旁核强烈表达(图3-B中箭头处),与野生鼠相比较(图3-A)肾素表达水平明显增加,为强阳性,表明VDR缺失肾素表达增强,VDR可抑制肾素在脑室旁核中的表达。同时PCR法测定结果显示VDR敲除鼠(ko)肾素在脑中表达也高于野生鼠(P<0.005,图3-C)。2.4vdr对小鼠肾素表达的影响实时定量PCR方法测定肾素在结肠上皮细胞的表达,VDR敲除鼠明显高于野生鼠,两者具有统计学意义(P<0.05),表明VDR的缺失使肾素在结肠上皮细胞中表达增强。2.5肾素活性与肾素活性的关系应用华盛顿大学检验医学部的新方法测定野生鼠(n=7)和VDR敲除鼠(n=7)血浆中肾素活性,两者有统计学意义(P<0.05,图5)。表明VDR敲除鼠血浆肾素活性增强,系统血浆中肾素水平增加可能是由于VDR敲除鼠的多个器官如心脏、肾脏、结肠、脑内的肾素均强烈表达,从而引起血浆中的肾素活性增加,而并不是单纯由于肾脏中肾素的强阳性表达引起。3讨论3.1对小鼠肾素表达的影响本研究中,应用免疫荧光染色后,VDR敲除鼠肾小球旁细胞(JG细胞)中肾素表达明显增强(图1-B),并且实时定量PCR结果肾素在VDR敲除鼠肾脏组织中表达显著高于野生鼠,表明由于VDR的缺乏引起了肾素在肾脏组织内的高表达,VDR抑制肾素在肾小球旁细胞中表达。本结果与Zou等研究的抑制野生型小鼠1,25(OH)2D3合成导致肾素表达增加的VD能调控肾素的结果一致。Li等研究表明VD3水平与血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ呈负相关。Qiao等给予野生型小鼠饮食添加锶,以抑制VD3生物合成后,其肾脏肾素mRNA表达明显上调,而经注射VD活性物后,肾素表达立即下调,提示活性VD3可抑制肾素的生物合成,是肾素表达的负性调节子。本研究结果与上述文献提示的结果基本一致,验证了VD3可作为肾素的负调节因子,VD缺乏可导致肾素系统(RAS)激活,VDR通过抑制肾素表达减轻肾脏损伤。3.2vdr基因敲除对小鼠血浆肾素活性的影响肾素在VDR敲除鼠心脏血管中表达强阳性(图2-B箭头处),表明缺少VDR的实验鼠肾素异常激活,VDR是肾素的负调节因子,可以抑制肾素在心脏血管内皮中的表达。而本实验结果中VDR敲除鼠的血浆肾素活性较野生鼠显著提高,两者有统计学意义(P<0.05),则表明当VDR敲除鼠多个器官内的肾素活性均增强时,其血浆中的肾素活性也明显提高,推测血浆中的肾素可能来自于系统中的各个器官,而不是单纯来源于肾脏球旁器,具体关联需要进一步的实验证明。Li等研究表明,在VDR基因敲除的小鼠中,肾脏肾素表达和血浆血管紧张素Ⅱ增加几倍,导致高血压、心脏肥厚和水摄入增加。以上研究与本实验结果提示VD是心血管RAS的一个负性调节子,VD缺乏可能是高血压发病危险因素之一,深入细致地开展VD和心血管疾病发病机制的研究,将可能对心血管疾病的防治提供新的途径。3.3vdr对小鼠肠道肾素的影响本研究还测定肾素在脑室旁核和结肠上皮细胞中的表达,VDR敲除鼠肾素在脑室旁核强烈表达(图3-B箭头处),表明VDR的缺失引起肾素表达增强,VDR可以抑制肾素在脑室旁核中的表达,对脑内肾素起负调节作用。中枢神经系统内的RAS用重组DNA技术、mRNA细胞自由翻译技术及定量放射自显影术证实了其在脑内的存在,而尤以丘脑下部、脑干及与控制水盐平衡有关的边缘系统含量最高,VDR可通过对脑组织内肾素的调控进而对高血压等疾病的发生产生抑制作用。本实验应用实时PCR法测定VDR敲除鼠肾素在结肠上皮细胞表达也高于野生鼠,两者有统计学意义(P<0.05),表明VDR的缺失可引起肾素在结肠上皮强力表达。现有研究结果表明,胃肠粘膜上分布的RAS中的血管紧张素ⅡAT1受体可能参与胃窦激素的信号调节,胃肠黏膜AT1受体高表达时引发幽门螺杆菌感染几率正常人高3~4倍。本研究结果与大量实验结果相同,提示VDR可以通过抑制肠道中的肾素表达,发挥“器官保护性”的作用。综上,通过动物实验显示VDR对肾脏、心、脑、结肠组织