家畜饲料中添加兽药的危害

家畜饲料中添加兽药的危害

1药物的致死量型大环内酯类抗生素是用放线菌或小单胞菌生产的大环内酯类抗生素的总称。它由两个糖基和一个大环内酯组成，这对革兰氏阳性和腺体的抑制非常有效。其化学结构和抗菌作用相近,按其大环结构含碳母核的不同,可分为14、15和16元环大环内酯类抗生素。近年来,作为动物饲料添加剂的大环内酯类抗生素已成为世界范围内需求量和销售速度增长增加最快的抗生素之一,已占世界抗生素市场销售总值的81.5%。此类抗生素在全球饲料添加剂中的使用量仅次于四环素类抗生素,我国是世界大环内酯生产第一大国,2002年的产量已达到72000t,超过世界总产量的2/3。大环内酯可从肠道吸收,能产生交叉抗药性。自1952年发现代表品种红霉素以来已连续有竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素、罗红霉素、麦迪霉素、交沙霉素、克拉霉素及它们的衍生物问世,并出现动物专用品种如泰乐菌素、替米考星等。阿维菌素,伊维菌素也属于大环内酯类,具有广谱杀寄生虫作用,并无抗菌活性。属十四碳大环的有红霉素、竹桃霉素;属十六碳大环的有泰乐菌素、吉他霉素和螺旋霉素,替米考星是泰乐菌素的半合成化合物,相比于其它大环内酯类抗生素有相似或更强的抗菌活性。大环内酯类抗生素为中谱抗生素,起作用均很相似。细菌对此类抗生素易产生耐药性。这些残留的原因主要是不遵守休药期规定,未正确使用抗生素,以及饲料和产品在加工、生产过程中受到污染。动物经过长期食用后,抗生素及其代谢物在动物的组织及器官内蓄积或贮存。药物在体内蓄积达到一定的浓度,可造成前庭和耳蜗神经的损害,导致眩晕和听力减退。严重者造成肝肾的严重损害。如不能很好地控制残留,不但对人类健康构成严重威胁,畜禽产品的出口贸易更是困难重重。因此我国制定了红霉素,螺旋霉素,替米考星,泰乐菌素等7种大环内酯类抗生素的最高残留量。2大环内酯类抗生素残留分析2.1样品前处理2.1.1缓冲溶液的配制大环内酯类抗生素呈弱碱性,微溶于水。在水溶液状态下一般易被分解,尤其在酸性条件下更不稳定。常用的提取试剂Tris缓冲溶液,偏磷酸-甲醇,MCI-Vain-EDTA缓冲溶液,硼酸盐缓冲溶液,甲醇等。本实验应用上述提取方法萃取肉组织时发现效率没有显著差异。但Tris缓冲溶液不适合提取肝脏,因为提取出的肝红素干扰实验操作。偏磷酸-甲醇溶液和其他缓冲溶液需要调至精确地pH值,提取后还要进行过滤等复杂操作,所需时间较长。通过实验结果表明,甲醇适用于多种基质中提取大环内酯,而且并能提取出大环内酯的多个组分,易于浓缩,便于以后的净化处理。2.1.2固相萃取柱的选择目前生物基质的净化方法主要包括液液萃取、固相萃取,基质分散固相萃取、液液萃取结合固相萃取。对于生物组织样品脂肪、蛋白等杂质是主要的干扰物质,有效的去除脂肪不但能够提高方法灵敏度,还能延长仪器和色谱柱的寿命。采用单一的液-液萃取方法处理样品,检测结果背景干扰大、低浓度下回收率低,容易产生假阳性。而SPE既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富集,是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。夏敏采用MCI-Vain-EDTA缓冲溶液提取肉中5种大环内酯类抗生素,样品通过预先用甲醇,水活化后的C18固相萃取柱,再用5ml水洗涤小柱,5ml甲醇洗脱收集,样品回收率约为50%~60%。Ngoh应用C18固相萃取柱富集牛奶中替米考星,样品回收率达到97%~101%。Jsokolde等应用C18固相萃取柱富集牛奶中的泰乐菌素,加标水平在1mg/L和50μg/L时平均回收率分别为94%和89%,相对标准偏差RSD为4%~7%。MasakazuHorie等采用0.2%偏磷酸-甲醇(6∶4,v/v)提取肉,鱼中大环内酯类抗生素,然后通过OASISHLB进行净化:在用甲醇,水活化后,加入样品,再用水淋洗,最后采用甲醇洗脱,该方法在加标0.2μg/g时,样品回收率为70.14%~93.12%。CarmenLeal等则应用BondElutSCX进行净化:采用5ml甲醇和10ml0.1mol/LKH2PO4活化后,放入样品,10ml水和3ml0.1mol/LK2HPO4淋洗,最后采用甲醇洗脱,该方法样品回收率为60%~90%。我们评价了OasisHLB和WCX,MCX固相萃取小柱对大环内酯的净化效果。其中HLB使用了6cc/200mg和6cc/500mg两种柱子。每种柱子都用6ml甲醇和6ml水活化(WCX用pH=5的水活化),通过加入10ng标准的10ml水,之后用水淋洗,然后用5%甲醇氨洗脱。WCX和MCX对大环内酯净化浓缩效果不好。6cc/500mg的柱容量大,洗脱时所需溶剂量过大,较难洗脱。而6cc/200mgHLB小柱即可完全吸附提取液中大环内酯,又较容易洗脱。2.2大环内酯类抗生素残留分析方法目前有关大环内酯类抗生素检测技术主要有薄层色谱法(TLC),高效液相色谱(HPLC)法,液相色谱-质谱联用(LC-MS)法。2.2.1薄层色谱法(TLC)TLC法用薄层板将样品提取液中被测物展开分离后,测定样品与标准样品吸收光或采用发射光薄层扫描法测定。它设备简单,检验成本低,操作简便快速,通过变换不同的显色剂和检测方式可用于大量样品的测定,特别适用于无紫外吸收的杂质的检测。所以,在2000版的《中国药典》中,所有相关大环内酯类抗生素物质的检测都使用该法。TLC法也有明显的缺点:分离能力较差,检测灵敏度较低。2.2.2高效液相色谱(HPLC)法高效液相色谱法(HP-LC)[7,8,9,11,12,13,14,15,16]是目前广泛应用的一种分析方法。多组分分析采用梯度洗脱。使用的检测器通常为紫外检测器。目前已成为大多数大环内酯类抗生素残留的分析方法。Ngoh报道了用液相色谱法测定牛奶中替米考星,样品离心脱脂,然后通过C18固相萃取柱净化,用紫外检测器在280nm检测牛奶(50~200ng/ml)中替米考星的回收率为97%~101%。Jsokolde等报道了应用固相萃取HPLC技术测定了牛奶中泰乐菌素,采用C18色谱柱分离,用紫外检测器在287nm检测样品,检测限为10μg/L,加标水平在1mg/L和50μg/L时平均回收率分别为94%和89%,相对标准偏差RSD为4%~7%。高效液相色谱法实现了分离速度快,效率高和操作自动化。但某些大环内酯类抗生素在分子中缺乏特征紫外吸收时,如果使用普通的紫外检测器,由于含量较低,HPLC法将失去灵敏度的优势。2.2.3液相色谱-质谱联用(LC-MS)法随着大气压电离(API)技术的成熟和商品化仪器的普及,LC-MS(MS/MS)已经成为食品和环境中污染物定性、定量分析的重要手段。一般采用电喷雾接口,常压电离源,正离子方式。Jong-hwanLim等报道了采用LC-MS测定比目鱼中罗红素残留,在正离子检测方式下,选择离子(SIM)为83715m/z,喷雾气压是40psi(N2),温度为350℃,碎裂电压为100V。LOD为0.01ng/g,LOQ为0.1ng/g。MasakazuHorie等采用LC-ESI-MS测定肉和鱼中大环内酯类抗生素残留,m/z[M+H]734,688,772,828,728,916分别为EN,OM,KT,JM,MRM,TS的SIM;[M+2H]2+422和435为SPM和TLM的SIM。LOQ为0.01μg/g。MDubois等采用HPLC-MS/MS测定肉、鸡蛋和牛奶中大环内酯类抗生素,采用正离子全扫描(fullscanMS)和二级全扫描(fullscanMS2)检测,离子源温度为150℃,锥孔电压为30~50V,碰撞电压为25~50eV。不同基质中LOQ测定为1/2MRL。该方法灵敏度高、选择性和特异性好,能够对低浓度的样品进行很好的定性确认。但仪器价格昂贵且方法操作复杂,检测成本高。另外,目前大多国内质量标准中有关物质的检测方法缺乏可靠性和权威性。3