pcr-sscp检测结核分支杆菌耐药基因的临床应用

pcr-sscp检测结核分支杆菌耐药基因的临床应用

近年来，抗癫痫药物（ih）和李福平（racema）的发病率显著增加，影响了抗癫痫药物（mdr-t）的化疗效果，给控制淋巴结带来了困难。而传统的结核分支杆菌培养药敏不仅耗时长,在药物敏感性测定方面也存在一些问题,因此从结核分支杆菌耐药分子机制入手,了解其耐药情况,对指导治疗有重要的意义。本文通过Bactec-960仪快速培养增菌,聚合酶链反应—单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌临床分离株的rPOB、katG和rPSL耐药基因,联合药敏试验初步分析了临床应用情况,现将结果报告如下。1菌株鉴定和药敏试验1·1病人及标本来源114例病人均为结核科住院病人,其中男性79人,平均年龄(45.05±16.18)岁。女性35人。平均年龄(43.38±19.43)岁。病程1.5个月~26年,平均1.2年。均为继发性肺结核,其中轻度36例,中度46例,重度32例。均为痰涂片抗酸染色阳性,初治肺结核病人33例(入院前均未使用抗结核药物),复治肺结核病人81例,其中70例治疗不规范(化疗方案不合理,疗程不够,不规律用药,单药调整等)。全部病人清晨留痰,经Bactec-960增菌培养和7H9培养基培养,并按结核病诊断细菌学检验规程进行菌种鉴定和不同梯度的药敏试验。INH高浓度10mg/L,低浓度1mg/L;RFP高浓度250mg/L,低浓度25mg/L;SM高浓度100mg/L,100ng/L;EB高浓度50mg/L;低浓度5mg/L;K高浓度6mg/L,低浓度0.6mg/L;PZA高浓度50mg/L,低浓度5mg/L;O(氧氟沙星)2mg/L;PAS6mg/L。左旋氧氟沙星高浓度5mg/L,低浓度0.5mg/L,联合药敏浓度HR(H1mg/L+R50mg/L);HRS(H1mg/L+R50mg/L+S10mg/L);HRE(H1mg/L+R50mg/L+E5mg/L)。1·2试剂结核杆菌rPOB.katG,rPSL基因检测试剂盒由本院结核病研究室分子生物学实验室提供。7H9培养基由美国DB公司提供。药敏试剂本室自配。1·3方法1·3·1痰标本经前处理后,经Bactec-960仪培养3~7d,部分培养菌做药敏梯度试验,部分培养菌提取DNA。1·3·2DNA制备:采用本院结核病研究室自制的试剂盒提取DNA,置-20℃保存备用。1·3·3PCR扩增:按试剂盒说明书进行操作,扩增结核分支杆菌耐RFP基因rPOB产生307bp片段,扩增结核分支杆菌耐INH基因katG产生245bp片段,扩增结核分支杆菌耐SM基因rPSL产生267bp片段。耐药基因完全缺失,PCR扩增为阴性。1·3·4SSCP分析:将引物扩增阳性的基因产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,溴化乙锭染色后照相观察结果。1·3·5结果判定:根据凝胶上显现的不同带型,通过与野生型RFP、INH和SM标准株DNA扩增产物对照,即可确定突变基因型。2复治肺结核病人符合耐药情况分析2·1初治和复治肺结核病人结核分支杆菌耐药情况比较见表1。初治肺结核病人结核分支杆菌对药物耐药频率自高往低排列是RFP(5/11),INH(5/11),SM(4/11),PZA(4/11),EB(3/11),K(2/11),O(1/11),PAS(1/11)和左旋氧氟沙星(1/11)。其中RFP(高耐1例,低耐4例),INH(低耐5例),SM(高耐1例,低耐3例),PZA(低耐3例),EB(高耐1例,低耐2例),K(低耐2例),左旋氧氟沙星1例为低耐。复治肺结核病人结核分支杆菌对药物耐药频率自高往低排列是:INH(65/81),RFP(63/81),EB(57/81),SM(55/81),K(44/81),PZA(43/81),PAS(36/81),O(17/81)和左旋氧氟沙星(16/81)。其中INH(高耐45例,低耐20例),RFP(高耐52例,低耐11例),EB(高耐27例,低耐30例),SM(高耐32例,低耐23例),K(高耐18例,低耐26例),PZA(高耐31例,低耐12例),左旋氧氟沙星(高耐4例,低耐12例)。有7例结核分支杆菌临床分离株HRE或HRS单药均耐药,但联合药敏敏感。2·2结核分支杆菌浓度与耐药基因突变关系分析见表2。从表中可以看出利福平、异烟肼和链霉素三种耐药基因突变率随着耐药浓度的增高而增加。3痰菌阴转和联合耐药基因检测选择资料完整的26例病例进行初步分析。3例初治病人开始使用HRZ治疗,2个月痰菌不阴转,药敏和联合耐药基因检测发现HR高耐并有耐药基因突变,改用力克肺疾、左旋氧氟沙星、乙胺丁醇等药物和免疫调节剂治疗,1月后痰菌阴性。9例复治病人药敏和联合耐药基因检测发现HRS高耐,HRS均有耐药基因突变,停用HRS,改用力克肺疾、氧氟沙星、丙硫异烟胺、丁胺卡那霉素和免疫调节剂等治疗3个月后,7例病人痰菌阴转。4例复治病人药敏和联合耐药基因检测发现HR其中有一药低耐,但无耐药基因突变,坚持HR联合用药,并加用O、K、P等药物及免疫调节剂治疗,2个月后痰菌阴转。3例复治病人药敏和联合耐药基因检测发现HRS均低耐,S或H有耐药基因突变,但HRE或HRS联合药敏敏感,在HRE或HRS基础上,加用氧氟沙星、丙硫异烟胺、PAS和免疫调节剂等药物,3个月后2例痰菌阴转,1例痰菌量明显减少。药敏和联合耐药基因检测发现H低耐,R高耐,均有耐药基因突变,E、Z也耐药。于是停用HREZ,改用O、P、K、力克肺疾和免疫调节剂等药物治疗,痰菌阴转。4例复治病人药敏和联合耐药基因检测发现H、R低耐,均有耐药基因突变,HR联合药敏耐药,停用HR,改用其它敏感药物,2个月后3例痰菌阴转。2例复治病人药敏和联合耐药基因检测发现H、R低耐,均有耐药基因突变,坚持H、R、O、P、Z、K等药物治疗,1例痰菌阴转。4耐药基因检测4·1有关结核分支杆菌耐药的分子机制的基础研究已有不少报道,认为耐利福平主要是由于靶分子RNA聚合酶β亚单位的编码基因rPOB突变所致,耐异烟肼主要与编码基因katG和inhA操纵子有关,耐链霉素则是编码基因rPSL,rrs突变。但临床标本经Bactec-960快速增菌,将耐药基因检测联合药敏试验用于临床指导治疗的文献很少,本文就这一问题进行了初步研究。研究结果表明,利福平、异烟肼和链霉素敏感株同样存在着耐药基因突变,突变率分别为6.5%、11.4%和27.2%,有关文献也有类似现象报道。解释这一现象的可能原因为耐药是每一种药物靶编码基因突变是逐渐积累的结果,PCR-SSCP很敏感,有很少量耐药菌也能扩增阳性而药敏表型不一定出现耐药。文献报道结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素的rPOB、katG和rPSL基因突变率分别为96%~98%、47%~58%和52%~59%。本文研究结果发现rPOB、katG和rPSL耐药基因突变率分别为60.2%、45.7%和62.7%,65%的病人为耐多药结核病人(MDR-TB),基因突变率报道的差异可能与各地区用药和菌株地区分布差异有关。耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增加,表明随着不规律用药时间的延长,使突变率增高,耐药性增强。4·2本文研究结果发现药敏梯度试验中部分结核分支杆菌对利福平、异烟肼和链霉素耐药,但未发现rPOB、katG和rPSL基因突变,提示我们结核分支杆菌的rPOB、katG和rPSL基因未突变并不意味着没有其它基因突变,可能存在其它耐药机制。4·3本组结果显示初治肺结核病人中有1/3的病人对一种以上抗结核药物耐药。这说明由于受到耐药结核杆菌感染,部分初治肺结核病人未治疗前已经耐药,如果对这些病人按常规化疗方案治疗,不做药敏和耐药基因检测,就会影响治疗效果。4·4临床治疗中发现一些肺结核病人尽管药敏试验提示H、R、或S部分低耐或全部低耐,但HRS或HRE敏感,在上述药物的基础上加用一些其他敏感药物和免疫调节剂也取得了较好的治疗效果。这可能有两方面的原因:⑴药敏试验RFP、INH、SM耐药只能证明病灶菌群中有耐药菌株存在,但并不全是耐药菌,如果耐药菌数量不多,继续使用RFP、INH效果就比较好;⑵使用RFP、INH的情况下,耐药菌活力和毒力可能较弱,强毒力的敏感菌也不易繁殖。4·5将常规药敏试验结果和耐药基因检测联合应用可以互相弥补,提供详尽的结核分支杆菌耐药情况,帮助临床医生制定合理的化疗方案,特别对MDR-TB病人治疗指导意义