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大鼠缺血缺氧后神经元型一氧化氮合酶和c-fos表达改变及脉络宁对其的影响
新生儿缺氧缺血性脑病是指新生儿缺氧引起的新生儿和新生儿脑损伤性疾病。这是儿童脑瘫和脑损伤的重要原因之一。虽然近年来国内外学者对缺血缺氧性脑损伤进行了大量研究,但其发病机制仍未完全阐明。电针和神经营养因子等治疗成年大鼠不完全性脑缺血或完全性脑缺血的研究报道很多,脉络宁治疗脑梗死的临床报道也不少。c-Fos可能参与缺血缺氧性脑损伤后海马神经元的修复和存活。在中枢神经系统,神经元型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)是产生一氧化氮(nitricoxide,NO)的重要酶之一,NO具有明显的双重作用。本研究通过制备新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型,采用免疫组织化学方法检测c-Fos和nNOS的免疫活性,探讨脉络宁对新生大鼠对c-Fos和nNOS的免疫活性表达的影响。1材料和方法1.1动物和试剂新生7d龄SD健康新生大鼠106只,雌雄不拘,购自江苏省实验动物中心。nNOS和c-Fos检测试剂盒购自北京中山生物技术公司。1.2动物的消毒处理生后7d的SD大鼠,乙醚麻醉,取仰卧位,四肢和头部固定于手术板上,颈部75%乙醇消毒,颈正中切口,游离右侧颈总动脉,用0-0丝线结扎1h后松开,局部75%乙醇消毒后缝合切口,然后将缺血1h的动物置于干燥器内连续通入含8%氧气和92%氮气的混合气体2h。缺氧缺血动物均经过1h缺血和2h缺氧处理。1.3动物下颌动脉管及微循环实验动物随机分为:(1)假手术组(n=30):再分为假手术即刻、3h、6h、12h和24h组,每组6只。动物颈部75%乙醇消毒,切开皮肤,分离右侧颈总动脉但不结扎,随后缝合颈部皮肤。(2)缺氧缺血组(n=40):分为缺血即刻(15min)、3h、6h、12h和24h组,每组8只。(3)脉络宁处理组(n=36):分为脉络宁处理6h、12h和24h组,每组12只。1.4剂量和给药量缺氧缺血动物从低氧环境取出后腹腔注射脉络宁注射液0.856mL(2次/d),注射剂量由动物给药公式换算,脉络宁由南京金陵药业股份有限公司生产,批号:Z320221102。假手术组和缺氧缺血组动物注射等量生理盐水。1.5rabcitib法实验大鼠断头取脑,4℃4%多聚甲醛固定12h,剥出全脑并切去小脑和嗅脑,4℃4%多聚甲醛固定24h,移至4%多聚甲醛(含20%蔗糖)过夜。脑组织冰冻切片40μm,选择有海马的脑组织经PBS液漂洗(5min×3)。nNOS免疫活性反应程序如下:(1)0.3%H2O2(甲醇配置)10~30min;(2)0.01mol/LPBS漂洗(5min×3);(3)1%羊血清孵育30min(37℃水浴);(4)加入1:400Rabbitanti-nNOS,4℃孵育过夜,37℃孵育1h;(5)0.01mol/LPBS漂洗(5min×3);(6)加入生物素化二抗(BiotunylatedAnti-RabbitIgG)37℃孵育1h;(7)0.01mol/LPBS漂洗(5min×3);(8)ReagentA(AvdinDH)与ReagentB(H/Biotin)在用前1h混合,37℃孵育1h;(9)0.01mol/LPBS漂洗(5min×3);(10)DAB显色,显微镜下控制显色时间;(11)蒸馏水漂洗(5min×3),0.01mol/LPBS漂洗(5min×3);(12)在PBS液内将经过免疫反应和显色的切片捞于载玻片;(13)免疫反应和显色切片自然干燥、脱水、透明、封片。C-fos免疫组织化学染色步骤同nNOS,但一抗为c-Fos。1.6大脑皮质免疫组化反应片采用半定量方法对nNOS阳性神经元计数,每只动物观察大脑皮质免疫组化反应片4张,在Olympus显微镜10×10视野下全部计数,取均数。应用SPSS12.0进行处理,数据用均数±标准差表示,组间比较采用t检验。2结果2.1嘴唇型肉胞菌,一般在半干和局部缺血缺血1h缺氧10min,动物出现兴奋躁动,呼吸频率加快,大多数出现摇头性震颤;缺氧20min,动物兴奋躁动加剧,摇头性震颤更加明显,口鼻紫绀;缺氧40min,动物躁动减少,但几乎所有动物出现全身性抖动,个别出现间歇性惊跳;缺氧50min,动物处于相对抑制状态,表现为点头呼吸,但频率仍然较快;缺氧60min,大多数动物再次出现兴奋躁动,约持续5min后转为全身性颤抖;缺氧80min,大多数动物处于抑制状态:不躁动,不抖动,也不惊跳。缺氧100min,绝大多数动物出现阵发性震颤,持续约2min后消失。2.2实验动物的生存除了在制备模型中,6只动物因血管破裂死亡外,在后续的实验过程中无一只动物死亡。2.3对nts阳性神经元的作用假手术组、缺血15min和缺氧缺血3h后,大脑皮质出现数量不等、反应活性不一的nNOS阳性神经元。免疫反应活性产物位于神经元胞体和突起内。免疫活性反应产物在突起内的分布不均匀,有些呈串珠状,有些呈细丝状。缺血缺氧6h,不同部位的nNOS阳性神经元开始增多;12h时明显增多,免疫反应活性显著增强,反应产物增多;24h时nNOS阳性神经元数量、免疫反应活性强度以及免疫活性反应产物均达高峰(表1、图1)。脉络宁处理6h组nNOS阳性神经元数量和免疫反应强度与缺氧缺血6h组无明显差异。脉络宁处理12h组nNOS阳性神经元的数量、免疫反应强度和nNOS反应颗粒均较缺氧缺血12h组有一定程度的减少和减弱。与缺氧缺血24h组相比,脉络宁处理24h组nNOS阳性神经元数量明显减少,免疫反应活性明显减弱(表1、图2)。2.4c-fos阳性神经元的表达免疫组化显示,c-Fos表达定位在神经元核内。假手术组下丘脑室旁核和海马仅有极少数c-Fos阳性神经元,缺血15minc-Fos阳性神经元略有增加。缺氧缺血3h下丘脑室旁核和海马CA2、CA3和CA4区等可见较多c-Fos阳性神经元;缺氧缺血6h,c-Fos阳性神经元数量达高峰(图3、图4);缺氧缺血12h,c-Fos阳性神经元数量减少,反应活性减弱;缺氧缺血24h,c-Fos蛋白表达呈现多变态势,部分神经元重新出现较强表达。脉络宁处理6h组,c-Fos阳性神经元少于缺氧缺血6h组;脉络宁处理12h组,下丘脑室旁核和海马CA2、CA3和CA4区c-Fos阳性神经元增多;脉络宁处理24h组上述区域c-Fos阳性神经元多于脉络宁处理12h组和缺氧缺血24h组(图5、图6)。3络宁对新生儿缺氧活检中nos的生长和调节NO是一种气体型神经递质和信息分子。NO调控中枢和周围神经递质的传递,不需要中介机制就能快速扩散通过生物膜,将细胞信息传递到周围的细胞。中枢神经系统NO的合成步骤:突触前膜释放兴奋性氨基酸激活突触后膜上的谷氨酸受体,引起Ca2+内流,Ca2+与钙调蛋白结合,激活NOS,催化L精氨酸产生NO和胍氨酸。正常情况下,神经元合成并释放生理剂量的NO,不产生毒性作用。研究表明,脑缺氧缺血时,神经元内的氧化代谢、线粒体呼吸和氧化磷酸化功能障碍,只能依靠葡萄糖无氧酵解产生能量,此时产生的ATP仅为有氧代谢的1/19。缺氧缺血后,ATP产生下降,离子泵系统功能障碍,钙内流,钙与钙调蛋白结合激活NOS而产生NO。缺氧缺血新生大鼠经脉络宁处理12h和24h,无论是nNOS阳性神经元的数量,还是免疫反应强度和nNOS反应颗粒基本维持在同一水平。这提示,脉络宁通过调控使nNOS处在一定范围内。无论是新生儿缺氧缺血,还是新生大鼠缺氧缺血,机体均可启动神经系统损伤机制和神经系统保护机制。缺氧缺血后,nNOS活性增强,NO含量增高,生理剂量的NO激活鸟苷酸环化酶,使血管平滑肌松弛扩张血管,改善血供。但是,如果nNOS活性不断增强,NO的含量不断增高,则会凸显NO的负面效应。NO可介导细胞内依赖Ca2+的一系列生化级联反应,引起核酸、蛋白质和磷脂降解;氧自由基形成;线粒体功能障碍,甚至导致细胞死亡。此外,NO还可引起蛋白质的ADP-核糖化,使蛋白质结构和功能发生改变,导致能量迅速衰竭。脉络宁的药理作用包括扩张血管、改善微循环、增加血流量,似乎与NO的生理作用相似。本实验结果表明,脉络宁处理24h可使nNOS水平维持在缺氧缺血12h水平。我们推测,脉络宁可能是通过抑制nNOS表达对新生缺氧缺血大鼠有一定的保护作用。多数学者认为,c-Fos参与缺氧缺血后神经元的修复、再生和生长。本实验表明,c-Fos呈规律性表达:假手术组和即刻缺血(15min)刺激,海马和下丘脑室旁核仅有少数神经元表达c-Fos;缺氧缺血3h,表达c-Fos的神经元开始增加,6h时达高峰,12h时开始减少,但24h时回升。脑缺氧缺血数小时神经元c-Fos高表达可能与机体的应激反应有关。脑缺氧缺血后通过什么途径调控c-Fos的表达,目前还不清楚,或许是兴奋性氨基酸受体被激活,与细胞内钙超载有关,或许是NO的参与。c-Fos的即刻表达可能是神经元自我保护的体现,缺氧缺血对侧下丘脑室旁核,特别是对侧海马c-Fos的低表达就是佐证。只有存活的细胞才能表达c-Fos,死
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