hplc-msms法检测水产品中7种大环内酯类抗生素残留

hplc-msms法检测水产品中7种大环内酯类抗生素残留

大环内酯类抗生素是一种非常重要的抗菌化合物。属于中光谱抗生素，广泛用于医学和现代医学领域。它对革兰氏阳性、部分革兰氏阴性和腺体的维持有很强的作用。随着MALs的广泛运用,MALs会通过食物链进入人体、危害消费者的健康。动物性食品如水产品中MALs残留检测方法的研究非常必要,目前有关MALs残留检测方法的研究主要有液相色谱(HPLC)法和液/质联用(HPLC-MS和HPLC-MS/MS)法。其中HPLC法一般配紫外检测器(UVD),包括二极管阵列检测器(DAD)或荧光检测器(FLD),对大环内酯类抗生素的残留进行检测。由于各种MALs的结构特征、理化性质和生物学效应很相似,其中某些MALs[如红霉素(ERM)和竹桃霉素(OLD)]在分子中缺乏特征紫外吸收,所以只用紫外检测器很难进行高灵敏度分析,另外HPLC法存在着干扰大、不能同时检测多种药物的局限性。液/质谱联用法是确证检测类似MALs这样较高分子量和多官能团残留物的较理想方法,该法具有较高的灵敏度和选择性,对液相分离度要求不高,可用于MALs残留的确证分析。相关文献的报道主要集中在畜禽[9,10,11,12,13,14,15]、蜂蜜和牛奶等样品中MALs药物残留的分析,而水产品中MALs残留分析的液质联用法研究鲜有报道。1材料和方法1.1试剂与标准品液质联用仪由Surveyor液相色谱系统和ThermoFisherTSQQuantumUltra三重四极杆串联质谱(配有电喷雾电离源)构成;Milli-Q去离子发生器(美国Millipore公司出品);ZZDCH16水浴氮气吹干仪(广州智真生物科技有限公司出品)等。替米考星(TIL)标准品(纯度为98.5%)、泰乐菌素(TYL)标准品(纯度为99%)、吉他霉素(KIT)标准品(纯度为72%)、螺旋霉素(SPI)标准品(纯度为96%)、OLD标准品(纯度为96.5%)、ERM标准品(纯度为92.2%)、交沙霉素(JOS)标准品(纯度为98%)均购于Dr.EhrenstorferGmbH公司。甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司出品);其他试剂均为分析纯;水为二次蒸馏水。1.2样品处理1.2.1样品制备取试样可食部分,用组织捣碎机充分捣碎,使之均匀,分别装入洁净容器中,密封注明标记,于-18℃以下冷冻存放备用。1.2.2样品中乙腈提取法准确称取样品5g(精确至0.01g)置于100mL具塞塑料离心管,加入20mL乙腈,于旋涡混合器上以2000r·min-1振荡1min,超声5min,以3500r·min-1离心6min,取上清液转移至另一离心管中,样品残渣再加入15mL乙腈重复提取1次,合并上清液。将上述乙腈提取液过预先用5mL乙腈润洗的中性氧化铝柱,提取液过柱后再用5mL乙腈淋洗柱体,合并于梨形瓶中。向梨形瓶中加入4mL异丙醇,在40℃水浴中旋转蒸发至干(如遇蒸不干的情况,转用氮吹仪吹干),准确加入2mL乙腈-0.05mol·L-1乙酸铵溶液(体积比2∶8)溶解残渣,再加2mL乙腈饱和正己烷,洗脱液转移至10mL离心管中,旋涡10s后,以3000r·min-1离心8min,取下层清液过0.22μm滤膜,待测。1.3测量1.3.1流动相、柱温度色谱柱为MGⅡC18(5μm,2.0mm×150mm);梯度洗脱的流动相为0.1%甲酸水溶液(A)+乙腈(B);流速为200μL·min-1;柱温为25℃;进样量为10μL。1.3.2仪器和质谱分析采用电喷雾(ESI)离子源,正离子(+)扫描方式,选择反应监测(SRM)检测模式。数据采集参数:scanwidth(m/z)=0.500;scantime(s)=0.020;电喷雾电压4000V;鞘气为氮气,压力36units;辅助气为氮气,压力7units;碰撞气为氩气;离子源温度350℃;在线切换阀0~7.5min至废液,7.5~9.5min进质谱分析,9.5min至废液。定性离子对、定量离子对、碰撞气能量见表1。2结果与讨论2.1流动相梯度洗脱优化分离此类药物的流动相一般主要有铵盐-乙腈或甲醇、某酸水溶液-乙腈或甲醇,文献中一般采用的流动相有乙酸铵-乙腈、甲酸铵-乙腈、乙酸铵-甲醇、甲酸水溶液-乙腈、乙酸水溶液-乙腈、甲酸水溶液-甲醇等。试验中比较了甲酸水溶液-甲醇和甲酸水溶液-乙腈2种流动相的分离效果。结果显示,甲酸-乙腈作流动相时的响应值和峰形更好,7种目标物的分离情况良好,故选择甲酸水溶液-乙腈为流动相。流动相梯度洗脱程序优化(A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈),使样液中7种MALs分离效率达到最佳。梯度洗脱程序见表2。2.2最佳检测条件的确定用注射针吸取7种MALs混合标准溶液(0.50μg·mL-1)通过蠕动泵以10μL·min-1的速度直接注入离子源,在正离子扫描方式下,分别进行一级质谱分析(Q1扫描)、二级质谱分析(子离子扫描)和选择反应监测(SRM)分析,接着分别对碰撞气能量(CE)、电喷雾电压、鞘气压力、辅气压力及离子源温度进行优化,使每种抗生素的分子离子与特征碎片离子(子离子)产生的离子对信号强度达到最大,从中选择每种抗生素的监测子离子对。优化的结果见表1。7种MALs参考保留时间(min)为OLD8.57,ERM8.67,KIT9.00,JOS9.25,SPI8.05,TIL8.28和TYL8.74。7种MALs标准物质选择反应监测色谱图见图1。2.3基质效应对离子化的影响基质效应是指在样品测试过程中由于待测物以外的其他物质的存在,直接或间接影响待测物响应的现象。为考察试样基质对7种MALs离子化的影响程度,试验做了2组比对,第1组(Set1)为7种MALs混标用定溶液作为稀释液;第2组(Set2)为7种MALs混标用制备好的空白试样提取液作为稀释液。当基质效应(ME)值等于或接近100时,表明不存在ME的影响;当ME值大于100时,表明存在离子增强作用;当ME值小于100时,表明存在离子抑制作用。试样基质对某些目标物(尤其是TIL)的离子化有着较强的抑制作用(表3)。为了在一定程度上消除ME的影响,根据试样制备相应的空白样品提取液作为标准液的稀释溶液,这使得标准品和样品液具有一样的离子化条件。2.4标准曲线的绘制准确移取适量标准储备液用空白样品提取液分别配成7种MALs质量浓度为1ng·mL-1、5ng·mL-1、10ng·mL-1、25ng·mL-1、50ng·mL-1、75ng·mL-1和100ng·mL-1。分别以OLD、ERM、KIT、JOS、SPI、TIL和TYL的峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程及相关系数(R)。7种MALs标准曲线的线性方程、线性相关系数和检出限数据见表4。2.5回收率和精度2.5.1加标回收率和精密度试验在确定检测方法后,用不含7种MALs的凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)样品在4μg·kg-1、20μg·kg-1和40μg·kg-13个水平进行加标试验,其回收率和精密度测定结果见表5。可知在3个添加水平上7种MALs平均回收率为75.4%~99.1%,相对标准偏差均在15%以内,说明该方法重现性良好。2.5.2方法的回收率为研究方法的适用性,分别选取不含7种MALs的杂色鲍(Haliotisdiversicolor)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)、加州鲈(Micropterussalmoides)、锯缘青蟹(Scyllaserrata)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)和罗非鱼(Oreochromisspp.)为测试对象,用该方法在20μg·kg-1添加水平上进行加标回收率试验,其结果可知7种MALs的