肥大细胞在大鼠胰腺组织纤维化形成中的作用及机制

肥大细胞在大鼠胰腺组织纤维化形成中的作用及机制

胰腺纤维素是由于各种原因引起的慢性胰腺的共同特征，是其病史的一个重要阶段。其中胰腺星状细胞(PSC)占据重要地位。最近已证实,肥大细胞在肾脏间质纤维化、心力衰竭、肝脏纤维化、肺脏纤维化、腹膜粘连、伤口愈合、炎症性肠病等疾病的发生和发展中起有重要作用。肥大细胞释放的胃食糜酶可刺激间隙成纤维细胞生长,上调细胞外基质(ECM)合成及诱导炎性细胞趋化和浸润,参与组织纤维化的发生和发展。而且胃食糜酶在血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)的产生,尤其是局部组织ANGⅡ形成中起重要作用。ANGIⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)中最主要的活性物质。最近研究发现,胰腺组织也存在局部组织RAS,并参与胰腺组织生理和病理调节过程。本研究旨在探讨胰腺组织肥大细胞、ANCⅡ与PSC的关系,从而研究肥大细胞在胰腺纤维化中的作用和机制。大鼠胰腺组织amesimb检测1.实验动物和材料:雄性SD大鼠,体重160～180g,购自上海必凯实验动物中心。实验前于本院动物实验中心饲养2周,常规饲料及饮水,昼夜交替12h,环境温度,湿度适宜,饲养环境为清洁级。三硝基苯磺酸(TNBS)、色甘酸钠和48/80复合物均购自Sigma公司;Trizol试剂、MMLV逆转录酶购自Gibco公司;羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)、羊抗小鼠IgG-HRP购自AntibodyDignostica公司;兔抗大鼠AT1、AT2多克隆抗体、兔抗大鼠转化生长因子(TGF)β1、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(SMA)多克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP购自SantaCruz公司。2.动物模型和分组干预:雄性SD大鼠120只,术前禁食不禁水12h,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,剂量为3ml/kg体重,经逆行胆胰管注射2%TNBS诱导建立大鼠慢性胰腺炎模型。随机分为三组:色甘酸钠组、48/80复合物组和对照组。上述各组分别于制模后当天开始每天给予色甘酸钠10mg/kg、48/80复合物500μg/kg或等容积生理盐水进行不同的干预。每组各40只大鼠,于制模后第3天、1、2、3和4周(每时点8只)分别予大鼠麻醉后剖腹,取胰腺组织,部分胰腺组织用10%中性甲醛固定,部分胰腺组织用液氮冻存。3.胰腺组织病理学分析、胶原纤维染色、肥大细胞染色、计数:甲醛固定的胰腺组织标本石蜡包埋、3μm连续切片,行H-E染色,并在光镜下观察分析。应用改良VanGieson胶原纤维染色法观察胰腺组织纤维化。应用KS400图像分析系统对胰腺组织胶原纤维染色半定量,采用KS4002.0软件系统计算。采用硫堇蓝(toluidineblue)染色光镜下观察肥大细胞的分布和脱颗粒情况。随机选取10个不同区域,分别计数单位面积中肥大细胞数量。4.免疫组化染色:应用PAP两步法检测胰腺组织α-SMA、TGFβ1的表达并观察其分布。5.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR):研究胰腺组织ANGⅡAT1、AT2受体mRNA表达。6.统计学分析:计量资料用表示。应用SPSS10.0统计软件对组间数据进行方差分析齐性检验,方差相齐时进行方差分析(ANOVA)或非参数统计,配对数据采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。大鼠胰腺组织肥大细胞数量及免疫组织at1、tgf1的表达变化1.胰腺组织病理形态学变化:光镜下观察H-E染色及胰腺纤维化组织学评分发现,各组早期(3d、1周)胰腺组织表现主要以炎性细胞浸润、间质水肿、腺泡细胞脂肪变性、片状坏死为主,炎性细胞以中性粒细胞为主。但色甘酸钠组的炎症较48/80复合物组和对照组程度轻微。各组均无纤维化。随着制模时间延长(2、3周),淋巴细胞增加,中性粒细胞减少,并出现慢性肉芽肿、嗜酸粒细胞聚集;胰腺水肿逐渐减轻;腺泡细胞坏死萎缩逐渐增加,并出现假性导管。胰腺组织纤维化逐渐明显。上述表现于4周时最明显,而对照组和48/80复合物组上述表现明显重于色甘酸钠组。各组肥大细胞硫堇蓝染色均可见明显肥大细胞染色阳性。但色甘酸钠组肥大细胞数量明显少于对照组和48/80复合物组。各组改良VanGieson染色在纤维化区域均可见明显胶原纤维染色阳性,而对照组和48/80复合物组胶原纤维阳性较色甘酸钠组明显。胶原纤维染色图像扫描分析结果显示,对照组胰管周围和小叶间胶原纤维阳性染色所占面积在术后第3周为10%±4%,于第4周最强为42%±8%。术后第4周,色甘酸钠组胰管周围和小叶间胶原纤维阳性染色所占面积为25%±8%,48/80复合物组为56%±12%。2.胰腺组织肥大细胞数量、分布及活化情况:早期(3d、1周)硫堇蓝染色阳性肥大细胞数量各组均较少(P>0.05)。随着制模时间的延长,各组均可见肥大细胞数量逐渐增加,至4周时达高峰。与对照组比较,48/80复合物组数量较多(P<0.05),但色甘酸钠组数量较少(P<0.01)。48/80复合物组和对照组肥大细胞数量和纤维化之间存在明显相关性:分别为γ=0.81(P<0.01)和γ=0.75(P<0.01)。见表1。3d时肥大细胞仅分布在血管和(或)胰管周围结缔组织中,可见脱颗粒现象。肥大细胞数量1周时较3d时减少,少见脱颗粒现象。2周后肥大细胞数量开始增加并活化,表现为脱颗粒,并与成纤维细胞密切接触。主要分布于坏死纤维化区域。4周时达高峰。与对照组比较,48/80复合物组肥大细胞数量增加和活化明显,主要分布于坏死纤维化区域;色甘酸钠组肥大细胞数量及脱颗粒现象少于对照组。3.免疫组化染色观察胰腺组织α-SMA、TGFβ1,蛋白表达的变化:各组第3天时可见胰腺组织α-SMA、TGFβ1,蛋白表达阳性,并随时间延长,上述各项指标阳性表达逐渐增强,至第4周时最强。α-SMA蛋白第3天时阳性表达见于胰腺腺泡周围间质细胞,第4周时其阳性染色广泛分布于血管壁及萎缩的胰腺腺泡周围间质中;TGFβ1,蛋白阳性表达第3天时主要分布于间质细胞,第4周时分布于间质细胞、炎性细胞和部分胰腺腺泡细胞。与对照组比较,48/80复合物组大鼠胰腺组织α-SMA、TGFβ1蛋白阳性表达均有不同程度增加。而色甘酸钠组上述蛋白阳性表达均有不同程度减少。见图1。4.RT-PCR观察胰腺组织AT1、及AT2受体mRNA的表达:对照组大鼠胰腺组织AT1及AT2受体mRNA表达呈进行性增加。与对照组比较,48/80复合物组大鼠胰腺组织AT1及AT2受体mRNA阳性表达均有不同程度增加。而色甘酸钠组两种蛋白阳性表达均有不同程度的减少。见图2。本研究中,与对照组比较,色甘酸钠组胰腺组织肥大细胞明显减少,同时炎症和纤维化减轻,而48/80复合物组大鼠胰腺组织肥大细胞明显增加,胰腺组织炎症和纤维化加重。究其原因除色甘酸钠稳定肥大细胞外,它还抑制肥大细胞的分化和增殖。色甘酸钠可抑制T细胞增殖、胞质产生及与细胞外成分连接和移动。在硬皮病和肝硬化等慢性炎症和纤维化发生时,肥大细胞数量增加明显,也同样存在肥大细胞动力学变化。肥大细胞在慢性胰腺炎过程中的动力学变化,证实肥大细胞参与大鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化的发生和发展。在胰管内注射2%TNBS诱导大鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化形成过程中,PSC活化具有重要作用。而α-SMA是PSC活化的重要标志。色甘酸钠组大鼠胰腺组织α-SMA表达量较对照组各时点均减少,提示色甘酸钠可通过稳定肥大细胞而抑制PSC的活化和增殖;48/80复合物组大鼠胰腺组织α-SMA表达量较对照组各时点均增加,提示48/80复合物可通过活化肥大细胞而促进PSC的活化和增殖。肥大细胞激活导致脱颗粒释放多种生物活性介质,其中包括具有免疫调节及促炎作用的细胞因子如TGFβ1,等,藉此参与多种疾病的发生。在TNBS诱导的大鼠结肠炎模型中,肥大细胞促进成纤维细胞增殖,增加胶原合成和收缩活性,从而参与该模型胃肠道炎症和纤维化的发展。本研究中对照组和肥大细胞激动剂48/80复合物组TGFβ1mRNA和蛋白表达增加,而肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠组其表达降低。而TGFβ1可通过旁分泌和自分泌方式激活PSC,是胰腺纤维化细胞因子网络调解中最重要的促纤维化因子。因此,色甘酸钠可通过稳定肥大细胞,降低其活化,下调生物活性因子TGFβ1等的表达,进而抑制PSC活化。与对照组比较,AT1和AT2受体mRNA和蛋白在48/80复合物组其阳性表达增强,而色甘酸钠组中则减弱。而ANGⅡ是通过与其受体结合继而激活下游信号转导途径发挥其生理病理调节作用。首先,ANGⅡ作为一种促炎因子,可增加血管通透性,并介导炎症因子、趋化因子等炎症相关因子的表达。其次,ANGⅡ是一种促纤维化因子,它可通过“ANGⅡ-TGFβ1-ECM”调节轴调控间质细胞分化、增殖及ECM代谢,从而促进纤维组织过度沉积,导致纤维化的发生和发展。肥大细胞活化后上调TGFβ1,ANGⅡAT1和AT2受体表达,提示肥大细胞可通过ANGβAT1和AT2受体发挥ANGⅡ作为促炎因子和“ANGⅡ-TGFβ1-ECM”调节轴促纤维化的作用。总之,色甘酸钠通过稳定肥大细胞,降低其活化,下调生物活性因子TGFβ1等的表达,进而抑制PSC活化及其促纤维化作用;而48/80复合物可通过活化肥大细胞而上调TGFβ1表达,促进PSC活化、增殖,促进纤维化的发生和发