一氧化氮和内皮素1在大鼠脑损伤中的作用

一氧化氮和内皮素1在大鼠脑损伤中的作用

临床上，下肢移植的重建、严重的下肢压缩和长期使用止血带可导致下肢缺氧，引起下肢红细胞的形成。上述情况在肢体恢复血流灌注后,不仅缺血组织出现更严重的损伤,而且可以进一步导致远隔器官损伤及脑损伤。目前肢体缺血再灌注(limbischemia/reperfusion,LI/R)后的脑损伤已引起有些学者注意,有关研究证实,一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)参与了组织缺血再灌注损伤。我们在大鼠LI/R损伤模型上,对NO/ET-1比值的变化与脑损伤的关系进行了初步探讨。1材料和方法1.1大鼠肢体活检健康雄性Wistar大鼠,体重200~250g,河南医科大学动物中心提供。动物随机分成5组(n=8):(1)对照(Control)组;(2)缺血/再灌组(I/R);(3)L-Arg+I/R组(L-Arg);(4)AG+I/R组(AG);(5)BQ123+I/R组(BQ123)。采用我室常规方法复制大鼠肢体缺血/再灌注损伤成功模型,大鼠术前12h禁食,自由饮水。乙醚浅麻醉下以止血带环绕结扎大鼠双后肢根部,迅速完全阻断动物后肢动静脉血流,结扎4h后松开止血带恢复血流灌注4h,对照组仅以止血带松弛环绕双后肢。于松扎前20min向腹腔注入1%戊巴比妥钠溶液(0.4ml/kg)麻醉,左侧颈外静脉注入1000U/kg肝素抗凝血,L-Arg组、AG组和BQ123组均于松扎前20min经颈外静脉给药,给药量分别是L-Arg为150mg/kg、AG为30mg/kg,BQ123为7μg/kg,上述三种药物均购自美国Sigma公司,药物溶于生理盐水(NS)(4ml/kg)进行滴注,于60min内滴完。对照组及I/R组仅滴注相同剂量的NS。1.2动物血浆及脑氧化物歧化酶活性测定各组动物于松扎后4h自腹主动脉放血处死动物并收集血液离心(3500r/min,15min)取血浆,分装在Eppendorf管中,-70℃保存备用。同时开颅取脑,滤纸吸干水分,-70℃储藏备用。采用试剂盒测定各组动物血浆NO、ET-1、丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)及脑组织tNOS、iNOS、cNOS、NO、ET-1、MDA、XOD、髓过氧化物酶(MPO)、SOD的变化。NO、MDA、XOD、NOS、MPO、SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。血浆及脑组织中ET-1含量的测定采用放射免疫法,试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。LDH采用日本HITACHI7200型全自动生化分析仪进行测定,试剂盒购自北京中山生物工程高技术公司。以上均按试剂盒说明进行操作。1.3统计分析数值以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,应用SPSS统计分析软件进行One-WayANOVA分析q检验统计处理。2结果2.1l-arg对sod活性的影响I/R组动物血浆MDA、XOD、LDH与对照组比较均明显升高(P<0.01),而SOD活性明显降低(P<0.01)。给予L-Arg后,MDA、XOD、LDH较I/R组降低,SOD活性升高;滴注AG后,MDA、XOD、LDH较I/R组升高,SOD活性降低。给予BQ123后,MDA、XOD、LDH较I/R组降低,而SOD活性升高(表1)。2.2no、no/et-1对I/R组动物血浆NO、ET-1与对照组比较均明显升高,而NO/ET-1比值降低(P<0.01)。与I/R组比较,L-Arg组NO、NO/ET-1明显升高,ET-1降低(P<0.01);AG组NO、NO/ET-1比值降低,ET-1与/R组比较差异无显著性(P>0.05);BQl23组NO、NO/ET-1值升高,ET-1明显降低(表2)。2.3l-arg对大鼠脑损伤的影响I/R组动物脑组织NO、ET-1、MDA、XOD、MPO与对照组比较均明显升高,而NO/ET-1比值和SOD值降低(p<0.01)。与I/R组比较,L-Arg组和BQl23组NO、NO/ET-1比值升高,MDA、XOD、MPO降低,SOD值升高,脑损伤减轻;滴注AG后NO、NO/ET-1比值、SOD降低,而MDA、XOD、MPO升高(p<0.05),脑损伤加重(表3)。2.4tos、inos和cnos活性的比较与对照组比较,I/R组动物脑组织tNOS和iNOS明显升高,而cNOS明显降低(P<0.01),L-Arg组tNOS、iNOS和cNOS活性与UR组比较差异无显著性(P>0.05);滴注AG后,tNOS、iNOS值均明显低于I/R组(P<0.01),cNOS与I/R组比较差异无显著性(P>0.05):BQ123组tNOS、cNOS均高于I/R组(P<0.05),iNOS值与I/R组比较差异无显著性(P>0.05)(表4)。3治疗前脑损伤的关键指标—讨论研究表明,ET与NO的动态平衡对于脏器功能的调节至关重要。本实验结果显示,LI/R后血浆和脑组织中NO、ET-1均明显增加,但ET-1增加的幅度大于NO,使NO/ET-1比值降低,同时脑的过氧化损伤程度增加,自由基清除酶SOD活性降低可能与缺血缺氧使SOD生成不足、清除过多氧自由基时的消耗等有关。为进一步说明NO、ET-1与脑损伤之间的关系,我们利用L-Arg、AG和BQl23进行干预。给予L-Arg后,血浆及脑组织中NO水平升高,而ET-1减少。L-Arg组NO/ET-1比值较I/R组明显升高,脑损伤减轻;而静脉注射AG后,tNOS和iNOS活性下降,NO生成明显减少,NO/ET-1比值下降,组织损伤加重;给予BQ123后,ET-1水平明显下降,NO水平上升,这可能与血管内皮细胞损伤减轻有关,NO/ET-1比值较I/R组升高,脑损伤减轻,提示NO/ET-1平衡关系的变化可影响肢体缺血再灌后脑损伤的程度。ET-1是一种强效及长效的血管收缩肽,对脑血管具有强大的收缩作用。它主要通过作用于ETA受体发挥缩血管作用。BQl23是一种特异性ETA受体阻断剂。多种因素如缺氧、缺血、炎症介质等均可引起血管内皮细胞受损,ET-1产生和释放增多,ET-1又可进一步引起缺血组织血管收缩,加重组织缺血缺氧。ET-1可通过引起胞内钙超载、中性粒细胞聚集粘附、增加自由基的产生及导致微循环障碍等途径引起组织损伤。MPO增多反映中性粒细胞聚集增强,文献报道中性粒细胞聚集、粘附可使微血管阻塞,再灌注时出现缺血器官的“无复流”现象。激活的中性粒细胞可释放蛋白酶并产生自由基。氧自由基可以使细胞膜产生脂质过氧化,使细胞膜的流动性降低和通透性增加,引起血管通透性改变、血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)功能障碍和神经元损害。肢体缺血再灌注后,血管内皮细胞受到刺激使ET-1分泌增多,同时以NO为代表的EDRF水平也明显升高。在一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)作用下,以分子氧和L-Arg为底物生成NO。NOS分为两型即结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)。cNOS主要存在于血管内皮细胞和神经元细胞中,受钙离子和钙调蛋白的调控,生理刺激后活化释放少量NO,具有调节血压、抑制中性粒细胞聚集、粘附等作用。iNOS主要存在于炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞以及成纤维细胞等,不受钙离子及钙调蛋白调控。正常生理情况下iNOS少有表达,在内皮素、细胞因子等介导下可产生大量NO,具有清除氧自由基等作用。LI/R后自由基产生增多,而自由基清除能力下降,机体脂质过氧化增强,中性粒细胞在脑部浸润,缺血组织血管通透性增大,胞浆酶LDH外溢。给予L-Arg治疗后,NOS活性虽无明显变化,但NO生成增多,使脑损伤减轻。相反,给予AG后,tNOS、iNOS活性降低,NO产生明显下降,组织损伤加重。给予BQl23后,NO生成增多,其对抗ET-1的作用,降低血管的反应性维持器官的灌注、抗血小板和