大剂量甲基强的松龙对急性脊髓损伤大鼠脊髓nogo-a蛋白表达的影响

大剂量甲基强的松龙对急性脊髓损伤大鼠脊髓nogo-a蛋白表达的影响

成熟动物中枢神经系统（cns）的再生能力非常薄弱，主要与两个因素有关。首先，cns本身的再生能力不足。其次，各种外源性和内源性生长抑制因素的影响——cns。脊髓少突胶质细胞所分泌的Nogo-A蛋白是目前已知最强的神经轴突生长抑制因子,对受损神经元再生具有极强的抑制作用。一些研究表明[2、3],在急性脊髓损伤的各个时期脊髓组织中Nogo-A的表达量具有明显的差异,更有实验研究表明抑制Nogo-A蛋白的表达有助于脊髓损伤的修复和再生。甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)是目前公认为对急性脊髓损伤有治疗效果的药物,其能否影响Nogo-A的表达少有报道。本实验应用大鼠急性脊髓损伤模型,早期尾静脉注射大剂量MP,观察其对Nogo-A表达的影响。1材料和方法1.1动物中心分组成年SD大鼠56只,体重250g~300g,雌雄不拘,均购自南方医科大学动物中心。随机分3组,分别为正常组(A组,8只)、单纯脊髓损伤组(B组,24只),脊髓损伤后大剂量MP治疗组(C组,24只)。B、C组按损伤后3、7、14d分为三个时间点,每个时间点8只。1.2c组治疗方法15%水合氯醛(3~4ml/kg)腹腔内注射麻醉,显露大鼠T8~T10椎体,仔细咬去椎板及两旁少部分椎弓根,显露T8~T10硬脊膜,A组直接关闭切口;B、C组采用改良Allen打击法(50g·cm)垂直打击大鼠T8~T10节段脊髓致伤脊髓,逐层缝合。C组于术后1h内给予甲泼尼龙琥珀酸钠(辉瑞公司)30mg/kg尾静脉15min缓慢注射,随后按5.4mg/kg/h计算23h总计量,分3次(8h/次)腹腔内注射。B、C组大鼠每日早晚两次挤压膀胱排尿,术后前3d腹腔内注射生理盐水10ml/次,2次/d,青霉素钠40万U/d,以保持水电解质平衡并预防感染。1.3大鼠后肢运动功能术后3、7、14d分别观察脊髓损伤组及MP治疗组大鼠后肢运动功能情况,并行BBB评分。1.4损伤节段腰椎的制备在相应时间点各取2内大鼠用水合氯醛(6ml/kg)腹腔内注射麻醉大鼠后,打开大鼠胸腔,以7号半输液器针头插入大鼠左心房直至主动脉内,剪开右心耳,生理盐水100ml快速灌注大鼠心脏,再以4%多聚甲醛快速灌注约15min后,控制滴速(20滴/min)再灌注3h。以T8~T10为中心,取损伤节段脊柱约2cm,以巩膜咬切器仔细咬去椎板、椎体和周围附着的瘢痕组织,将完整的脊髓组织剥离出来,用磷酸缓冲液(TBS)清洗组织后,置于4%多聚甲醛中保存。常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度5μm,各组切片均进行HE染色和用Nogo-A单克隆抗体(博士德公司,武汉)进行SABC免疫组化染色。1.5总蛋白的提取术后3、7、14d分别处死B、C组大鼠(每组每个时间点6只),取T8~T10节段脊髓,并取A组相同节段(6只)脊髓,置于-70℃冰箱保存。取各脊髓组织标本40mg,加入细胞裂解液30μl,冰浴下研磨匀浆,煮沸后7500r/min离心取上清,再加入等体积的2倍十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液,提取总蛋白。10%SDS-聚丙酰按凝胶(PAGE)电泳,电泳结束后按常规转膜(PVDF膜,4℃,2.5h,50V),TBS液()缓慢振荡清洗5min×3次。在膜封闭液(含1%BSA和0.02%Tween20的TBS)内封闭,4℃保存6h,加入一抗,与封闭液混匀后,4℃冰箱过夜。TBS液清洗PVDF膜5min×3次,加入封闭液7ml,抗羊抗兔IgG二抗(博士德,1∶400稀释)室温振荡混匀1h,TBS清洗膜5min×3次,加入化学发光剂(SantaCruz),在暗室条件下显影和定影制成X线片。将各组X线片扫描后采用C-IMAGINGSYSTEMS软件进行灰度分析,以Nogo-A蛋白和内标蛋白(Actin)灰度的比值作为Nogo-A蛋白的相对表达量。一抗分别为兔抗Actin抗体(博士德公司,1∶400稀释)和兔抗Nogo-A抗体(博士德公司,1∶400稀释),其中Actin作为内标蛋白。1.6两组大鼠术后运动功能强调者采用SPSS10.0统计软件,数据结果以表示,比较正常组、对照组和MP组大鼠后肢运动功能BBB评分及大鼠脊髓Nogo-A的表达量差异,采用析因方差分析,单独效应分析采用单向方差分析和LSD法进行多重比较,显著性水平为P<0.05。2结果2.1运动功能恢复B组及C组损伤后3d时大鼠BBB评分均为0分,后肢无明显运动功能恢复,损伤后7、14d,大鼠后肢运动功能开始逐渐恢复,但B组与C组各个时间点的BBB评分无显著性差异(表1)。2.2b、c组不同损伤后髓组织病理学表现A组大鼠脊髓结构清晰,可以见到条状排列的神经纤维和大量的少突胶质细胞核(图1,后插页Ⅷ);损伤后3d,B、C组早期出现脊髓组织充血,脊髓组织神经纤维逐渐坏死,神经纤维断裂、消亡,脊髓组织呈空泡样的变化明显增加(图2,后插页Ⅷ);在损伤的后期,脊髓组织中出现胶原纤维(瘢痕组织),空泡较早期少且致密。2.3髓剑和胞浆内的表达Nogo-A蛋白在A、B、C组各个时期均有表达,其表达产物主要在少突胶质细胞的髓鞘和胞浆内(图3、4,后插页Ⅷ)。在A组表达量最小,呈弱阳性表达。在B、C组不同时间的表达强度有较明显的差异,7d>14d>3d。但是沈镜下观察B组和C组大鼠在同一时间点的Nogo-A表达强度差异并不明显(图5、6,后插页Ⅷ)。2.4单独效应分析见图7、表2。Nogo-A蛋白在各组大鼠脊髓组织中均呈阳性表达,不同组和不同时间其表达量的差别都具有统计学意义(P<0.001)。C组在各个时间点的表达量低于B组(P<0.001)。单独效应分析对B与C组各个时间点Nogo-A表达均显著高于A组(P<0.001),7d时增加最明显,14d时的表达量仍高于A组;B组和C组在各个时间点Nogo-A表达量差异具有显著性(P<0.001)。3药物处理对髓胞运动相关基因表达的影响早在一个世纪以前,科学工作者就开始试图解开成年动物中枢神经轴突在受到损伤后不能再生的谜团。20世纪80年代,David的实验表明,一些成熟的中枢神经轴突可以长入外周神经移植物内。人们一度认为发生损伤的中枢神经轴突不能再生是由于中枢神经组织微环境中缺乏神经营养因子。但后来的实验结果表明,尽管存在神经营养因子,神经元轴突仍然难以再生。因此,一种新的设想应运而生:中枢神经系统组织具有抑制神经轴突再生的活性,而这种活性不能被神经营养因子的刺激所完全克服。同时有实验证实,在培养基中,神经轴突和成纤维细胞严格地绕开成熟的少突胶质细胞表面而生长。在神经元和少突胶质细胞共同培养的实验中,当接触到少突胶质细胞时,神经元轴突和生长锥就停止生长,而且这种对生长的抑制取决于同少突胶质细胞的直接接触,提示少突胶质细胞或其所形成的髓鞘膜具有强烈的抑制轴突生长的作用。因此,人们很自然地想到从中枢髓鞘中去寻找能抑制轴突生长的分子。髓鞘相关糖蛋白(MAG)是第1个在髓鞘中被分离鉴定的抑制物[10、11],紧接着又发现了在髓鞘中还存在相对分子质量分别为35000和250000的两种轴突生长抑制物,被命名为NI35和NI250。Schwab科研小组分离纯化了鼠NI250和牛NI220(bNI220),即Nogo-A,并利用NogoA克隆出Nogo基因。这一发现具有里程碑式的意义,为人类找到了阻止中枢神经再生的关键因素。目前发现Nogo基因编码3种蛋白质,包括Nogo-A、Nogo-B及Nogo-C蛋白。其中Nogo-A含1163个氨基酸残基,为Nogo基因的全长表达产物,分子量为250kD,它主要存在于CNS的髓鞘中。Nogo-A是目前已知最强的神经轴突生长抑制因子,它主要在成人CNS中的少突胶质细胞(Oligodendrocyte,Oligo)中表达,具有限制轴突的伸延及中枢损伤后轴突的再生能力。MP是目前公认对急性脊髓损伤有效的治疗药物,其作用机理目前仍不完全清楚。既往很多研究多认为MP最主要的药理作用是抑制过氧化和抗炎症反应,但是近来很多实验表明MP对神经细胞蛋白质的表达具有一定的调节作用。其机理主要是MP与细胞质内的糖皮质激素受体结合,转运至细胞核内与DNA上的特异性结构结合形成复合物,从而调控基因表达。有研究表明,早期应用大剂量(30mg/kg)MP能够增加大鼠急性脊髓损伤后神经细胞Bcl-2蛋白的表达并且减少受损脊髓神经细胞的凋亡。张强等的实验表明,大剂量MP对急性脊髓损伤大鼠脊髓GAP-43mRNA的表达有增强作用,可能能促进神经系统自发恢复和结构再塑,加强正常的发芽反应。本实验通过观察大鼠急性脊髓损伤后MP治疗组及对照组之间BBB评分差异,发现损伤后大鼠脊髓功能均有不同程度的恢复,但损伤组与治疗组之间BBB评分无明显差异。由于脊髓损伤的恢复是一个长期的过程,而本实验只观察了损伤后2周内的大鼠后肢运动功能BBB评分,说明至少在损伤后2周内MP治疗组与损伤对照组的大鼠后肢运动功能恢复无明显差异。本实验通过免疫组化的方法观察大剂量MP治疗大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织中Nogo-A蛋白的分布,多分布于脊髓神经纤维周围,呈包裹神经纤维的状态。由于Nogo-A主要由包绕神经纤维构成髓鞘的少突胶质细胞分泌,其免疫组化染色与理论上分布是一致的。在正常组中仅仅发现很少量的表达,染色呈浅棕色,而在损伤后随着Nogo-A表达量逐渐增加以及大量神经纤维坏死,其染