姜黄素对急性脊髓损伤大鼠运动功能的影响

姜黄素对急性脊髓损伤大鼠运动功能的影响

氧气反应应激活急性髓质伤理过程中的重要作用。因此，抗旱性损害是急性髓质伤理治疗的热点。在机体中,核因子E2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2,Nrf2)/抗氧化反应原件(antioxidantrespondelement,ARE)信号通路是非常重要的内源性抗氧化应激通路,它可以编码及调节多种抗氧化基因的表达,增强细胞对氧化应激的抵抗性,从而减少氧化应激对机体造成的损害。姜黄素来源于植物姜黄的干燥根茎,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、抗纤维化等一系列药理作用。最近有研究报道姜黄素能够改善急性脊髓损伤大鼠的预后,但其机制却不甚明确。本实验采用改良的Allen’s打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型,观察姜黄素对建模大鼠氧化应激损伤的保护作用以及对Nrf2/ARE/γ-GCS信号通路的影响,旨在探讨姜黄素对大鼠急性脊髓损伤的保护作用及其机制。材料和方法1实验试剂与模型的建立1.1SD雌性大鼠60只(重庆医科大学实验动物中心提供),体重200~250g;姜黄素与二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司),Nrf2抗体(Bioworld公司),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)抗体(Santacruze公司),β-肌动蛋白(β-action)抗体(北京博奥森生物技术有限公司),链霉菌抗生素蛋白-过氧化物连接(SP)免疫组化试剂盒、辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所),聚丙烯酰胺凝胶(SDS)配制试剂盒、电化学(ECL)发光试剂盒、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)。1.2急性脊髓损伤模型的建立采用改良的Allen’s打击法,10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠,将大鼠俯卧,固定于鼠板上,摘除T9~T10椎板,暴露脊髓,用自制改良的Allen’s打击器以50g/cm(重量为10g的击打棍从5cm高空自由落体)的致伤能量造成脊髓急性损伤,撞击成功标志为:撞击脊髓组织水肿、出血,硬脊膜完整,但呈紫红色,大鼠尾巴出现痉挛性摆动,双下肢躯体回缩样扑动,呈迟缓性痉挛。模型制作成功后需每日2次挤压膀胱排尿,直至形成膀胱反射。1.3实验分组SD雌性大鼠60只,随机平均分为假手术组、模型组、姜黄素低剂量组(40mg/kg,CUR-L组)、姜黄素高剂量组(100mg/kg,CUR-H组),各组均为15只。将姜黄素溶于0.1%DMSO的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中,其中姜黄素高、低剂量组在脊髓损伤前1d给予相应剂量的姜黄素腹腔注射,每日1次,持续7d。假手术组和模型组腹腔注射等体积含0.1%DMSO的PBS溶液。2检测方法2.1运动功能方面采用脊髓损伤后后肢运动功能评分系统(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能,观察其后肢的关节活动、步态等运动功能。评分共分为3个部分:第1部分评价动物后肢各关节活动(0~7分);第2部分评价动物后肢步态及协调功能(8~13分);第3部分评价动物后肢运动中爪的精细动作(14~21分),3个部分满分共21分。评分者为非本实验组人员且熟知BBB评分标准,每只动物均评定3次。2.2mda含量测定于设定实验时间点麻醉处死大鼠,取损伤段脊髓组织,用4℃生理盐水按1:9(W/V)制成10%的脊髓匀浆,将匀浆液以3000r/min离心15min后取上清液,参照试剂盒说明严格操作测定MDA含量。2.3蛋白凝胶的制备取脊髓组织80~100mg匀浆,RIPA裂解并用BCA法测定蛋白浓度,每组取相等蛋白量进行SDS电泳,将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室温下5%脱脂奶粉封闭2h,Nrf2、γ-GCS一抗稀释比例1:1000,4℃孵育过夜;二抗稀释比例为1:1000,37℃孵育1h,ECL发光显色;感光胶片压片,内参采用β-actin。以Nrf2/β-actin和γ-GCS/β-actin的灰密度比值作为目标蛋白相对表达量。2.4固定方法固定于设定实验时间点麻醉处死大鼠,经左心室灌注肝素化生理盐水,直至灌注液清亮后再以4%多聚甲醛灌注行在体脊髓组织固定。随后分离脊髓组织固定于4%多聚甲醛24h,常规石蜡包埋,冠状切面切片,苏木精-伊红(HE)染色,树脂封片后镜下观察脊髓组织病理变化。2.5胞浆用焦色表达检测采用北京中杉金桥公司SP法免疫组化试剂盒进行染色操作,严格按照其说明步骤进行。Nrf2一抗稀释比例1:100,以胞浆棕褐色为阳性表达;γ-GCS一抗稀释比例1:50,以胞浆棕褐色为阳性表达。实验结果由两位专业免疫组化实验人员进行独立评定,采用inmagepro-plus6.0对目标蛋白进行分析,以平均吸光度值为标准对各组目标蛋白进行评定。3软件分析数据采用x¯±sx¯±s表示,SPSS11.5软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析,组间进一步两两比较采用SNK-q检验,P<0.05为有统计学意义。结果1两组假手术组的比较假手术组评分基本正常;模型组评分显著低于假手术组(P<0.05);CUR-L组及CUR-H组评分明显高于模型组(P<0.05),但仍低于假手术组,见表1。2各组大鼠髓组织mda含量比较模型组大鼠脊髓组织MDA含量较假手术组明显升高(P<0.05);CUR-L组及CUR-H组大鼠脊髓组织MDA含量较模型组明显下降(P<0.05),但仍未达到假手术组水平,见表1。与假手术组相比:*P<0.05;与模型组相比:#P<0.053各组nrf2蛋白表达水平比较结果显示,模型组Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平明显高于假手术组(P<0.05);与假手术组比较,CUR-L组及CUR-H组Nrf2蛋白表达水平逐渐增强(P<0.05);CUR-L组γ-GCS蛋白水平高于模型组(P<0.05),CUR-H组γ-GCS蛋白水平明显高于模型组(P<0.05),见图1,表2。与假手术组相比:*P<0.05;模型组相比:#P<0.054神经元的缺如假手术组大鼠脊髓灰白质交界清楚,无出血及水肿灶,神经元丰富,核仁清晰,无核固缩及坏死现象;模型组可见散在的出血灶,间质水肿并有空腔形成,大量炎性细胞浸润,胶质细胞增生,正常的细胞形态严重破坏,细胞变性坏死严重,神经元大量丢失甚至缺如;CUR-L和CUR-H组与模型组相比,炎性细胞明显减少,胶质细胞增生不明显,细胞排列较为整齐和规则,变性坏死的细胞明显减少,仅能够观察到少许细胞的核固缩现象,有较多的神经元存活;其中,CUR-H组较CUR-L组改变更为明显,见图2。5各组nrf2、-gcs蛋白表达水平比较免疫组化检测结果显示,模型组Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平均明显高于假手术组(P<0.05),与模型组比较,CUR-L组、CUR-H组Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平逐渐增强,CUR-H组增高更为显著(P<0.05),见图3、4,表3。与假手术组相比:*P<0.05;与模型组相比:#P<0.05nrf2/关于-gcs信号通路研究表明,脊髓损伤造成的最终神经功能障碍主要由两种机制引起的,即原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤多为由外力造成的机械性损伤,且产生的神经损害是不可逆的。继发性损伤发生于原发损伤后的数分钟到数天内,现多认为由原发性损伤造成的髓鞘和轴突的破坏、局部组织缺血、水肿、血管痉挛、微循环障碍而引发的一系列细胞内代谢和基因改变,包括局部血管的改建和缺血、炎性递质的聚集、与脂质过氧化反应有关的自由基损伤、兴奋性递质与电解质失衡等。这些变化相互促进相互影响,会加重脊髓的损伤程度,甚至会引起原发性损伤后幸存下来的神经细胞继发性凋亡或坏死。其中,氧化应激反应中产生的大量活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)与自由基在继发性损伤的发生、发展上起着关键的作用。在评价机体氧化应激的程度时,MDA是最常用的指标之一,机体内过多的氧自由基能攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并形成脂质过氧化物,如MDA,因此测试MDA的含量能够反映机体内脂质过氧化程度,间接地反映组织细胞受到氧化应激损伤的程度。本实验中,大鼠模型组脊髓组织MDA含量显著高于假手术组,说明损伤后大鼠的脊髓组织中存在着氧化应激损伤。当脊髓组织遭受氧化应激损伤时,细胞内抗氧化防御系统对于降低氧化应激引起的神经元损伤至关重要,其中Nrf2/ARE信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路,Nrf2是亮氨酸拉链转录激活因子家庭(CNC)家族成员,共有一高度保守的碱性亮氨酸拉链(leucimezipperbZIP)结构。生理状态下主要在细胞质中与Keap1(Kelch-likeECH2associatedprotein1)蛋白结合,不具有转录活性。当受到内源性或外源性ROS等亲电子物质的攻击时,Nrf2与Keap1解离并转位进入细胞核与与Maf蛋白结合成异二聚体后与ARE序列结合,进而启动下游受ARE调控的抗氧化基因的转录,提高机体抗氧化应激的能力。到目前为止,已发现Nrf2/ARE信号通路调控的可编码内源性基因超过200个,其中,作为Nrf2/ARE信号路径的主要调节蛋白,抗氧化酶类不仅能够催化自由基转化为无毒物质,还能加强其水溶性利于其排除,是机体维持氧化还原平衡的重要因素。γ-GCS就是机体内非常重要的受此通路编码调节的一类抗氧化蛋白酶,γ-GCS是体内还原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶,是一个由重链亚单位(γ-GCSh)和轻链亚单位(γ-GCSl)组成的二聚体。重链具有全酶的催化功能,轻链无催化活性,但对重链的活性起调节作用,机体内γ-GCS的含量和活性的升高,可以增强组织细胞抗氧化的能力。实验中我们发现模型组Nrf2和γ-GCS蛋白表达水平明显高于假手术组,说明急性脊髓损伤后的氧化应激损伤能够导致Nrf2/ARE信号通路的激活,继而上调γ-GCS的表达,共同参与到机体的抗氧化损伤防御。近年来姜黄素具有抗氧化作用已经受到人们的广泛关注,研究表明:姜黄素不仅能够激活多种抗氧化蛋白的表达,而且自身作为一种供氢体也是一种强有效的自由基清除剂,从而直接和间接地发挥其抗氧化作用。其对神经元的保护作用也在多项实验中得到证实,但它的这些作用是否与上调Nrf2/ARE通路有关却鲜有报道。本实验中,我们观察到CUR-L组和CUR-H组能够明显地上调Nrf2蛋白的表达,进而促进抗氧化蛋白酶γ-GCS的表达增强,而组织中MDA含量却明显降低,证明了姜黄素加强了脊髓损伤大鼠的抗氧化损伤能力。而且,通过对大鼠后肢功能评分和脊髓组织病理学检查我们也可以发现,姜黄素能够明显改善脊髓损伤后大鼠的神经功能恢复情况,减轻脊髓组织的损伤程度。这提示在脊髓损伤早期就运用姜黄素进行抗氧化治疗对疾病的预后是具有非常积极的影响的。姜黄素来源于姜科植物姜黄,而姜黄在中国和印度的传统医学中已被广泛运用,疗效肯定。而姜黄素作为姜黄的主要药理成分,其多种药理作用及安全性