不同移植时间窗对骨髓间充质干细胞移植的影响

不同移植时间窗对骨髓间充质干细胞移植的影响

近年来，随着神经生物学和干燥科学的发展，骨髓间质干燥物（msec）的移植和脊柱损伤（slac）的治疗取得了很大进展。许多研究结果表明,MSCs移植治疗SCI能明显改善损伤脊髓的神经功能,治疗作用与MSCs具有替代坏死神经元、分泌神经营养因子桥接作用和诱导等有关。然而如何把握MSCs移植的合适时间,目前的研究资料尚无肯定的答案。另外,不同移植时间窗对MSCs的生存、迁移及神经功能恢复影响的研究少见报道。为探讨MSCs移植的最佳时间,本研究观察了不同移植时间窗对经静脉移植的MSCs在大鼠损伤脊髓内存活和迁移及其对移植后神经功能恢复的影响。1材料和方法1.1idase活性变化选用清洁级健康雄性SD大鼠90只,2～3月龄,体质量150～250g,由福建医科大学实验动物中心提供。其中10只用于细胞培养取材;40只用于观察脊髓组织学和髓过氧化物酶(myoleperoxidase,MPO)活性变化,分8组:假手术组、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d组,每组5只;40只用于观察不同时间窗经静脉移植的MSCs在损伤脊髓内的生存数和迁移距离,分8组:假手术组、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d移植组,每组5只。主要试剂:αMEM培养基、胎牛血清(美国HyClone公司);胰蛋白酶(Trypsin1:250,Amersco);Ficoll-Paque分离液(美国Pharmacia公司);MPO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);核荧光染料Hoechst33342(美国PharMingen公司)。1.2良浚法良浚法按照文献报告,暴露胸10段脊髓,采用改良Allen法,致伤量为50g×cm,造成胸10段脊髓的冲击伤。假手术组大鼠同法暴露胸10段脊髓,不造成脊髓冲击伤。1.3cd45、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd49、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29按常规方法体外分离、培养MSCs,并传代,流式细胞仪检测第2代MSCs的CD34、CD45、CD29、CD90表达。收集第3代培养7～8d的MSCs悬液,用核荧光标记液Hoechst33342(10mg/L,αMEM/F12培养液配制)孵育2h,经细胞计数后制备浓度为1×106/ml的MSCs悬液,4℃下储存备用。1.4mscs细胞悬液的制备假手术组在手术后12h,移植组在动物模型建立后0、6、12、24h,3、5和7d,经尾静脉注射Hoechst33342标记的第3代MSCs单细胞悬液1ml。术毕放回笼中继续饲养。1.5损伤区头端髓组织的测定假手术组大鼠在手术后24h,损伤组于SCI后0、6、12、24h,3、5和7d7个不同时间点再次麻醉后迅速开胸,以4%多聚甲醛500ml经左心耳灌注固定,完整地切取损伤脊髓胸10～12节段。取损伤区头端脊髓组织约50mg,立即存放-70℃,待行MPO活性测定。取损伤区尾端脊髓组织浸入10%中性甲醛固定24h,常规乙醇脱水,石蜡包埋,以片厚5μm连续切片,H-E染色,在显微镜下观察损伤区脊髓病理组织学改变情况。1.6大鼠骨髓组织匀浆的制备取存放-70℃的大鼠损伤脊髓组织和假手术组相同部位大鼠脊髓组织,电子天平称重,按重量体积比为1∶19加匀浆介质制备成5%的组织匀浆。取组织匀浆进行MPO活性测定,具体操作过程严格按照试剂盒说明书进行。1.7运动功能观察和运动能力分析各组大鼠分别于移植前和移植后7d放在75cm×125cm的开放空间,采用BBB后肢运动功能评分标准,3人、双盲法独立观察大鼠双后肢的运动功能并记录。1.8骨髓纵向的荧光显微观察移植组大鼠在MSCs细胞移植后7d再次麻醉后迅速开胸,以4%多聚甲醛500ml经左心室灌注固定,完整地切取损伤脊髓胸10～12节段。用4%多聚甲醛后固定4h,再置于30%蔗糖溶液中浸泡至组织下沉到瓶底。用恒冷箱冷冻切片机做脊髓胸10～12节段连续纵切片,厚20μm。每组脊髓纵切片每隔5片取1片在荧光显微镜下(10×20)用410nm激发波长进行移植的存活细胞计数。用方格测试系统在每张纵切片的脊髓损伤区头端和尾端组织各取4个单位面积(0.16mm2),计数这些单位面积内所发出蓝色核荧光的细胞总数。计数时,以发出蓝色荧光、呈椭圆形或圆形、大小较均一的细胞核作为存活MSCs的细胞核。1.9移植细胞迁移距离每组脊髓纵切片每隔5片取1片在荧光显微镜下(10×20)用410nm激发波长进行移植细胞迁移距离的测量。应用荧光显微镜本身载物台标本移动距离测量尺测量移植细胞从脊髓损伤区边缘迁移到头端或尾端组织最远处之间的距离。1.10均数标准差记录采用SPSS10.0统计软件分析,各项检测结果以均数±标准差(x−±s)(x-±s)记录。两组间采用t检验,多组间采用单因素方差分析,检验水准取α=0.05,当P<0.05时差异有统计学意义。2结果2.1mscs的体外扩增培养的MSCs24h后逐渐出现贴壁,其他血细胞通过换液逐渐除去,此时贴壁细胞呈巨单核细胞,细胞形态不一,可有梭形、多角形或星芒状突起,为单个或多个细胞的克隆,细胞增殖迅速。12～14d,90%以上细胞融合,融合细胞都呈梭形,原代可获得1×106～2×106个MSCs。传代的细胞于24h内完全贴壁,形态多呈梭形,10～12d融合,体外扩增5代细胞数约为1×1011个。流式细胞仪检测10份第2代细胞样本,结果显示:CD34、CD45表达阴性,CD29、CD90表达阳性(图1)。2.2髓组织病理学结果假手术组神经元形态正常,整个组织结构完整清晰,未见肿胀改变,核圆,可见核仁。SCI后0h,脊髓组织结构未见明显异常;SCI后6和12h,脊髓实质内见少量点片状出血,同时部分神经细胞出现肿胀,核偏移,核仁尚清;SCI后24h,脊髓白质内可见大片出血病灶,脊髓组织实质内有大量中性粒细胞浸润,神经元和胶质细胞明显水肿,部分神经元固缩、变小,核萎缩,结构不清(图2A);SCI后3d,脊髓组织结构疏松,神经元大量坏死;SCI后5和7d,脊髓实质内神经元稀少,实质内胶质细胞增生形成瘢痕(图3)。2.3两组mpo活性表达比较大鼠SCI后不同时间脊髓组织MPO活性和假手术组大鼠脊髓MPO活性表达:假手术组和SCI后0h组MPO活性表达弱,分别为(4.39±0.48)nkat/g和(5.16±0.51)nkat/g;SCI后6h出现MPO活性表达增强(27.46±3.17)nkat/g,24h到达高峰(58.18±5.49)nkat/g,3d后开始下降(40.56±4.59)nkat/g,7d后回到假手术组水平(4.64±0.41)nkat/g(图4)。与假手术组比较,SCI后6h、12h、24h、3d和5d各组的MPO活性表达差异具有统计学意义(P<0.01),SCI后0h和7d2组的MPO活性表达差异无统计学意义(P>0.05);与SCI后24h组比较,其他各组的MPO活性表达差异有统计学意义(P<0.01)(图4)。2.4移植前各组大鼠的bcb评分差异每组大鼠移植前和移植后双后肢运动功能的BBB评分分数差异具有统计学意义(P<0.01),移植后大鼠BBB评分分数明显高于移植前,说明移植MSCs能明显改善大鼠双后肢运动功能(图5);移植后各组之间大鼠BBB评分分数差异具有统计学意义,SCI后3d移植组BBB评分分数明显高于其他6组(P<0.01),SCI后0、6、12和24h移植4组差异无统计学意义(P>0.05),SCI后5和7d移植2组差异无统计学意义(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠双后肢运动功能恢复最好。2.5d移植组与邻近组织治疗髓伤超氧时期血压ld在荧光显微镜下,可观察到各组的脊髓损伤处及其邻近组织有许多被Hoechst33342标记的移植细胞,移植的MSCs多数集中分布于脊髓损伤处,有部分迁移到邻近组织。每组大鼠脊髓损伤处头、尾端存活数差异无统计学意义(P>0.05);SCI后3d移植组大鼠脊髓损伤处头端、脊髓损伤处尾端存活数和存活总数明显高于其他6组(P<0.01)(图6～8);SCI后0、6、12、24h,5和7d移植组间差异无统计学意义(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠脊髓内移植的MSCs存活数最多(表1)。2.6髓内移植mscs的预测结果每组大鼠脊髓内移植的MSCs向头端和尾端组织迁移距离无统计学意义(P>0.05);SCI后0、6、12、24h和3d移植5组与SCI后5和7d移植2组相比有统计学意义(P<0.01),前5组脊髓内移植的MSCs向头端组织或尾端组织迁移距离明显大于后2组,SCI后0、6、12、24h和3d移植5组差异无统计学意义(P>0.05),SCI后5和7d移植2组差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。这提示SCI后5和7d移植的MSCs在损伤脊髓内迁移的能力明显下降。3讨论3.1髓组织mpo活性检测免疫炎症反应是SCI后的一种病理生理过程,在继发性脊髓损伤过程中发挥重要作用。中性粒细胞是急性炎症反应的主要炎症细胞,MPO是一种特异性酶,与中性粒细胞的绝对数量相关联,是一个定量中性粒细胞对损伤组织浸润的特异和敏感标记。因此通过MPO活性测定可用来定量分析脊髓组织炎症反应情况。本实验结果显示,在SCI后3d内,脊髓组织MPO活性明显增强,组织结构损伤严重,表明免疫炎症反应在脊髓继发性损伤中发挥重要作用。本实验结果同时显示,在大鼠SCI后3d,脊髓组织MPO活性表达减弱,说明SCI后3d,脊髓免疫炎症反应开始减轻。在大鼠SCI后5d和7d,脊髓组织MPO活性表达恢复到假手术组水平,但损伤区有胶质细胞增生,说明SCI后5d,由于免疫炎症反应,诱发了脊髓组织形成瘢痕。3.2mscs在不同组织区的迁移距离本实验观察到,各组大鼠SCI后经尾静脉注射MSCs,在脊髓损伤区及其邻近组织可检测到存活的MSCs,表明MSCs经静脉移植能透过血脑屏障,到达损伤区及其邻近组织。本实验结果显示,在SCI后0、6、12和24h不同时间窗经静脉移植的MSCs存活数量明显较少,说明SCI后的严重免疫炎症反应对移植的MSCs产生毒性作用,不利于MSCs的存活。但另一方面,在免疫炎症反应过程中,多种炎症因子、炎症细胞和细胞因子对移植的MSCs具有趋化作用,导致MSCs向损伤区及其邻近组织迁移,本实验观察到,在SCI后0、6、12、24h和3d不同时间窗移植的MSCs在脊髓组织内迁移的距离明显较长。本实验结果进一步显示,在SCI后5d和7d2个时间窗经静脉移植的MSCs存活数量较少,在脊髓组织内迁移的距离较短,推测这种现象与下列因素有关,SCI后5和7d,破坏的血脑屏障结构开始重建,透过血脑屏障的MSCs数量减少;SCI后5和7d,免疫炎症反应减弱,炎症细胞减少,多种炎症因子表达下调,对移植MSCs的趋化作用减弱;损伤区胶质细胞增生形成的瘢痕不利于移植MSCs的迁移。3.3动物源细胞毒性变化BBB评分法是评价脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复过程的的主要方法之一,本实验BBB评分结果显示,各组大鼠移植前和移植后双后肢运动功能的BBB评分分数有显著性差异,