蛋白酶激活受体2对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成早期损伤区神经胶质纤维酸性蛋白及波形蛋白表达的影响

蛋白酶激活受体2对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成早期损伤区神经胶质纤维酸性蛋白及波形蛋白表达的影响

有机质损害是中枢神经系统（cns）损伤后神经过渡的主要障碍之一。该标志是星形细胞中的丝质蛋白（gfp）和波形蛋白（iv）的强化。众多研究提示蛋白酶激活受体2(proteaseactivatedreceptor2,PAR2)可能在脊髓损伤后胶质瘢痕形成中起关键作用。本研究通过PAR2特异性抑制剂、PAR2特异性激动剂及PAR2siRNA对脊髓损伤后损伤区GFAP与Vimentin蛋白表达变化的影响,探讨PAR2对脊髓损伤后胶质瘢痕形成的作用,并为临床研究抑制胶质瘢痕形成促进神经轴突再生的治疗策略提供理论依据。1材料和方法1.1大鼠术后时间点筛选180只成年SpragueDawley(SD)雌性大鼠()购自重庆医科大学实验动物中心,并随机分为假手术组(shamoperation组)、模型组(model组)、PAR2激动剂组(SLIGRL-NH2组)、PAR2抑制剂组(FSLLRY-NH2组)及PAR2siRNA组。每组大鼠36只,共选取术后第1d、7d及14d3个时间点,每个时间点大鼠12只,其中6只用于免疫荧光分析,另6只用于Westernblot分析。在整个实验过程中共有19只大鼠死亡,其中手术造模时麻醉致死5只,在术后辅助排尿过程中膀胱破裂引起腹膜炎症致死4只,术后肾衰死亡7只,不明原因死亡3只。在发现大鼠死亡时,均立即以符合实验要求的大鼠在相同的实验条件下再次造模并给予相应的干预,直至所有大鼠顺利存活至实验规定的时间,且所有研究组中没有因死亡造成的大鼠数量差异。1.2硬膜下foly-nh2的注射按照UsulH的方法进行。将大鼠麻醉消毒后暴露T11-12节段脊髓硬膜,用0.88N力Yasargil动脉瘤夹(65750T,Rebstock,德国)持续夹脊髓60s,造成脊髓严重损伤。伤后立即打开硬脊膜并于损伤局部硬膜下分别注射FSLLRY-NH210μL(10mg∕L,PAR-3888-PI,PEPTIDESINTERNATIONAL,美国)、SLI-GRL-NH210μL(100μmol∕L,ab120176,abcam,美国)、PAR2siRNA10μL(30mmol∕L,SC-156080,SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC,美国)及生理盐水10μL。注射完成后,于损伤处硬脊膜下腔留置导管并固定,缝合硬膜、肌肉,以含庆大霉素的生理盐水冲洗后缝合皮肤。伤后第2d,经留置导管注入与首次同剂量的干扰剂,完成后拔出导管。假手术组大鼠只打开椎板,不进行其他操作。所有大鼠术后给予辅助排尿及常规护理。1.3联合免疫治疗将大鼠麻醉,以4﹪多聚甲醛经心脏灌注固定后,取出脊髓组织(损伤旁各0.5cm)置于4﹪多聚甲醛中后固定4h,然后放入30﹪蔗糖溶液中脱水至其沉底。脱水完成后行冰冻切片(12μm)。PBS漂洗切片(5min×3)后以0.3﹪tritonx-100浸泡5min,再次PBS漂洗(3min×3)后以正常山羊血清封闭液封闭60min(37℃),去除多余封闭液后GFAP一抗4℃孵育过夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美国,1:40)。PBS漂洗切片(5min×3),相应二抗37℃孵育90min[Flur®488-ConjugatedAffiniPureGoatAnti-MouseIgG(H+L),ZF-0512,中杉金桥,1:200],经PBS漂洗(5min×3)后封片。在LEICATCSSP2激光共聚焦显微镜下观察并照相。1.4丙烯酰胺电泳将大鼠麻醉处死后取出脊髓组织(损伤旁各0.5cm),提取脊髓组织蛋白(P0013B,碧云天)。经变性后,测定蛋白浓度(P0010,碧云天)以定量结果,取50μg总蛋白样品经10%SDS(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺)电泳,转至PVDF膜(IPVH00010,Millipore,美国),以western封闭液封闭90min(37℃)。加入相应一抗4℃孵育过夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美国,1:500;Anti-Vimentinantibody[V9],ab8069,abcam,美国,1:1500),洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(GoatpolyclonalSecondaryAntibodytoMouseIgG1-heavychain,ab97240,abcam,美国,1:1000)37℃孵育90min,在暗室中经DAB试剂于PVDF膜上显色,扫描各免疫印迹条带并分析。1.5脊柱损伤后下肢运动功能的bbb评分伤后第1d、7d及14d对大鼠行后肢运动功能BBB评分,观察各PAR2干扰剂对其后肢运动功能的影响。1.6gfap阳性染色面积率gfap阳性染色面积率gfap阳性染色面积率用Image-ProPlus6.0软件分析计算免疫荧光图片中GFAP的阳性染色面积及组织总面积,求得GFAP阳性染色面积率(GFAP阳性染色面积/组织总面积)。以QuantityOne-4.6.2软件分析western条带阳性产物IOD值,计算阳性产物和内参GAPDH的IOD值比。1.7比较方法:均数标准差以IBMSPSSStatistics19行统计分析,统计数据皆用均数±标准差(x±s)表示。多组间比较用单因素方差分析,各组数据呈正态分布并经方差齐性检验后,两两比较采用最小显著差异法(LSD)或Tamhane,sT2检验。检验水准α=0.05,双侧检验。2结果2.1gfap阳性染色面积率损伤后第1d,各干预组GFAP阳性染色面积率与model组相比无显著差异(F=0.388,P=0.763)。伤后第7d及第14d,各实验组之间比较有显著差异(7d,F=76.250,P<0.01;14d,F=141.243,P<0.01)。两两比较显示,FSLLRY-NH2组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)的GFAP阳性染色面积率均显著低于model组;SLIGRL-NH2组(7d,P<0.01;14d,P=0.019)GFAP阳性染色面积率显著高于model组;而在FSLLRY-NH2组与siRNA组之间比较,GFAP阳性染色面积率未见明显差异(7d,P=0.289;14d,P=0.940)(图1,表1)。2.2gfap表达损伤后第1d,各干预组GFAP的表达与model组相比无显著差异(F=0.085,P=0.968)。伤后第7d及第14d,各组之间GFAP(7d,F=85.858,P<0.01;14d,F=163.143,P<0.01)的表达有显著差异。进一步两两比较显示FSLLRY-NH2组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表达低于model组;而SLI-GRL-NH2组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表达高于model组;而在FSLLRY-NH2组与siRNA组之间比较,GFAP的表达未见明显差异(7d,P=0.598;14d,P=0.713)(图2,表2)。2.3fluslr-nh2对sirnin蛋白表达的影响损伤后第1d,各干预组Vimentin蛋白的表达与model组相比无显著差异(F=0.423,P=0.739)。伤后第7d及第14d,各组间Vimentin蛋白(7d,F=66.040,P<0.01;14d,F=113.653,P<0.01)的表达有显著差异。进一步两两比较显示FSLL-RY-NH2组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA组(7d,P<0.01;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表达低于model组;而SLIGRL-NH2组(7d,P=0.001;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表达高于model组;而在FSLLRY-NH2组与siRNA组之间比较,Vimentin蛋白的表达未见明显差异(7d,P=0.900;14d,P=0.822)(图3,表3)。2.4运动功能bcb评分脊髓损伤后第1d及第7d(7d,F=2.626,P=0.079),各干预组大鼠后肢运动功能BBB评分无显著差异。而在伤后第14d,各实验组大鼠后肢运动功能BBB评分有显著差异(F=773.889,P=0.000)。进一步两两比较显示FSLLRY-NH2组(P=0.003)及siRNA组(P=0.006)BBB评分高于model组;而SLIGRL-NH2组(P=0.030)BBB评分则低于模型组(表4)。FSLLRY-NH2组与siRNA组比较无显著差异(P=1.000)。3par2对髓伤痛大鼠骨髓损伤后gfap和vintin表达的影响脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)是一种常见的高致残性伤害,造成了巨大的社会经济负担,然而针对SCI后损伤机制和治疗措施的研究至今仍未获得较为满意的结果。研究发现,CNS损伤后发生反应性胶质增生,初期可能有利于维持损伤局部微环境的稳定,但持续的胶质增生将导致胶质瘢痕形成,并成为损伤后轴突再生的主要障碍,这一点在SCI修复中表现得尤为突出。胶质瘢痕最主要的构成成份为星形胶质细胞,其在CNS损伤后反应性胶质增生的过程中大量增殖,并明显上调表达其细胞骨架的两种中间丝成分——GFAP和Vimentin,成为胶质瘢痕形成的标志。在我们前期的研究中亦发现,同时抑制中间丝GFAP和Vimentin的表达后,胶质瘢痕的形成减弱,神经芽生增强。该研究证实了GFAP、Vimentin在胶质瘢痕形成中的重要意义,同时亦初步证实抑制胶质瘢痕对神经再生的促进作用。然而作为胶质瘢痕基本构成成分,GFAP、Vimentin表达的分子调节机制至今仍不清楚。PAR2为PARs(G蛋白偶联受体家族)家族成员,其广泛地分布于CNS中的神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞,能被胰蛋白酶及肥大细胞类胰蛋白酶所激活,并在CNS炎症反应、缺血及神经退行性改变等病理过程中发挥着重要作用。众多研究提示PAR2可能在脊髓损伤后炎症反应介导的胶质瘢痕形成中发挥了重要作用,但目前尚缺乏相关研究证实。对此,本实验深入研究了PAR2对脊髓损伤早期损伤区GFAP和Vimentin表达的影响。结果表明,在脊髓损伤后的第7d及14d,FSLLRY-NH2组及PAR2siRNA组大鼠GFAP及Vimentin蛋白的表达低于模型组,而SLIGRL-NH2组高于模型组,差异皆有统计学意义(P<0.05)。在脊髓损伤后第14d的BBB评分表明FSLLRY-NH2组及PAR2siRNA组大鼠的BBB评分高于模型组,而SLI-GRL-NH2组大鼠的评分则低于模型组,差异皆有统计学意义(P<0.05)。然而,值得注意的是各干预组中BBB评分在伤后第7d与模型组相比未见显著差异(P>0.05),但仔细分析数据后发现FSLLRY-NH2组及PAR2siRNA组大鼠的BBB评分绝对值仍高于模型组,而SLIGRL-NH2组大鼠的BBB评分绝对值仍低于模型组。出现此种情况的可能原因为:本实验中造成的脊髓损伤重,伤后的运动功能恢复缓慢,且干预PAR2对脊髓损伤后功能恢复的影响可能具有时间累积效应,以致伤后第7d还不足以表现出统计学差异。但是,本实验也发现伤后第7d各干预组GFAP及Vimentin蛋白的表达与模型组相比具有显著差异(P<0.05),BBB评分结果似乎与此结果不一致,可能的原因为PAR2对脊髓损伤后功能恢复的作用是通过影响GFAP及Vimentin蛋白的表达进而影响神经轴突生长来完成,脊髓损伤后的功能恢复与GFAP及Vimentin蛋白的表达相比具有时间滞后性,因此在该两种蛋白表达表现出统计差异时,BBB评分却未见统计学差异。这些结果表明在大鼠脊髓损伤早期激动PAR2能促进大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成早期损伤区GFAP与Vimentin的表达,而抑制PAR2则可抑制该两种蛋白的表达,并改善脊髓损伤后胶质瘢痕形成早期的后肢运动功能。从而初步证实了PAR2参与脊髓损伤后炎症介导的胶质瘢痕形成过程,PAR2可能是抑制损伤后胶质瘢痕形成的治疗靶点。然而,PAR2影响脊髓损伤后GFAP及Vimentin表达的具体机制是什么,目前尚未有直接研究证实,但近年的研究却提供了一些间接的线索。研究发现脊髓损伤后损伤局部的炎症细胞将释放大量前炎症因子,这些前炎症因子不仅可以激活星形胶质细胞中的PAR2,还可促进PAR2在该细胞中的表达上调。ParkGH等在细胞实验中发现激活的PAR2能激活cJun氨基端激酶(c-JunN-terminalKinase,JNK),并观察到星胶细胞形态变化;同时,GadeaA等在细胞研究中发现JNK激活后,GFAP及Vimentin表达增加、星胶细胞增生及反应性胶质化形成,而BernardiA在研究中发现抑制JNK激活后,GFAP表达下降。因此我们推