登革病毒病毒复制复合体的形成机制

登革病毒病毒复制复合体的形成机制

病毒登格病毒（den）是一种小的动物病毒。它的基因是一种单带正链流的病毒，长约11公斤。由单一的开放读码框(openreadingframe,ORF)编码一个约含3400个氨基酸残基的多聚蛋白(polyprotein),顺序为5′-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′,由病毒和宿主蛋白酶负责对其进行协同翻译和翻译后加工,最后形成3个结构蛋白(C、prM和E蛋白)和7个非结构蛋白。20世纪80年代以来,由登革病毒引起的登革热和登革出血热在世界范围的流行、暴发日益频繁,我国南方自1978年以来每隔几年就暴发一次。为了有效控制登革热的传播和流行,必须对病毒的感染及复制周期有一个全面的了解。有关登革病毒生活周期的基础研究目前越来越深入,本文将对这些研究进展作一综述。1den病毒中的rgd序列及整合素登革病毒感染的早期现象是病毒的吸附及穿入。病毒吸附蛋白(virionattachmentprotein,VAP)与细胞膜表面特异性病毒受体的结合往往决定了病毒的组织、细胞亲嗜性及随后的一系列病理反应,登革病毒的VAP为包膜蛋白E,含494个氨基酸及2个潜在的糖基化位点,12个保守的半胱氨酸残基,具有多个中和性表位,其中某些表位可能直接参与病毒包膜与宿主细胞的融合过程,其余的表位可能直接参与病毒-细胞受体分子的结合。在人体内DEN病毒侵犯的重要靶细胞类型为单核细胞、组织及骨髓细胞,在这些细胞中较易检测到高滴度的DEN病毒。DEN病毒与特异性细胞受体的结合依赖于E蛋白的二聚体结构,随后病毒包膜与细胞膜融合,该过程受包膜附近的低pH介导,使E蛋白的构象发生改变,由二聚体形成三聚体。对登革病毒E蛋白研究的逐步深入推动了细胞特异性受体的研究。黄病毒中TBE病毒E蛋白通过X射线晶体衍射技术已明确了其三维结构。由于DEN病毒E蛋白与TBE病毒E蛋白具有60%的同源性,通过ProMod及Swiss-Model软件,可准确预测DEN病毒E蛋白的三维结构如下:E蛋白以延伸的二聚体形式平躺在病毒表面,折叠成3个不同的区域,Ⅰ区是一个β-桶状中心结构,由氨基及羧基端序列产生;Ⅱ区形成一个延伸的指状结构,可能与E蛋白二聚体的形成及膜融合过程相关,Ⅲ区为IgG免疫球蛋白样折叠,由羧基末端区形成且延伸至病毒表面,具有与粘附分子中的整合素结合区域(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),简称RGD序列。目前已知口蹄疫病毒(FMDEN)、柯萨奇病毒及腺病毒均通过RGD依赖的方式与整合素结合进入细胞,因此DEN病毒中的RGD序列的存在使人不由想到这些病毒-细胞间的相互作用与整合素的参与有关。而实际情况并非如此,黄热(YF)病毒17D株的包膜蛋白亦具有一个可溶性的外露RGD序列,最近研究表明将RGD序列突变为RAD或RAE序列后,能完全破坏RGD序列与整合素的相互作用,将这些突变引入全长cDNA克隆,体外转录后,将突变体RNA转染C6/36细胞,于30℃培养几天后,可观察到细胞病变且培养上清中可检测到突变病毒子,说明突变的RNA基因组可在蚊细胞内复制和传播;将此培养上清于37℃接种BHK-21细胞并培养,BHK-21细胞可被感染,但不能传播至邻近的细胞。此外,加入高浓度体外合成的RGD多肽,也不能阻止YFV-17D感染原代鸡胚成纤维细胞。这些结果表明RGD序列介导的整合素结合过程在黄病毒与细胞吸附及穿入过程中并不起主要作用。另有实验表明,MVE病毒在人SW13细胞连续传代,获得的RGD→RGG、RGH突变体是减毒株,究其原因,发现RGD突变株产生的E蛋白在37℃不稳定。以上突变可能影响了E蛋白的折叠过程,也可能使E蛋白不能二聚体化或不能与prM蛋白相互作用,导致了降解,由此可见RGD序列对E蛋白构象的维持起重要作用,但黄病毒的细胞受体并非为整合素。Chen等认为DEN病毒与表达在基质及细胞膜上的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)的结合介导了病毒的吸附。可溶性GAGs能拮抗重组DEN病毒E蛋白与Vero细胞的结合过程,如肝素的半数抑制剂量(ID50)为0.3μg/ml,可见E蛋白与肝素具有较高的亲和性。由于肝素并非是细胞膜的组成部分,而与其具有结构同源性的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)广泛存在于细胞表面及其基质,它们的一级结构均为重复的二糖单位。也许DEN病毒的靶细胞受体为HS,且HS的硫酸化对E蛋白与受体的结合是必需的。将Vero细胞培养在含氯酸钠(硫酸化抑制剂)的培养基中,此时细胞的存活性并不受影响,但细胞与E蛋白的结合被抑制。可溶性的高度硫酸化HS能87%拮抗DEN病毒的感染。通过对E蛋白与GAGs的结合序列进行预测(在富含碱性氨基酸的区域找出被转角分开的某个区域,它们若对合在一起则认为是GAGs结合序列),得出E蛋白具2个GAGs结合区:E284～310氨基酸,位于Ⅰ区侧面及Ⅲ区的终端;E386～411氨基酸,位于Ⅲ区尾部,与前者的C端共同形成暴露在外的受体结合位点,Rey等认为DEN病毒E蛋白(281～423氨基酸)具有潜在的靶细胞结合活性。由于各种细胞来源的HS呈现高度的异质性,表现在一级结构及硫酸化水平的差异,对DEN病毒选择性组织亲嗜性也许可以如下解释:高硫酸化的HS能促进E蛋白的结合与感染,而低硫酸化的HS抑制E蛋白与细胞的结合。但近来的研究表明DEN病毒的穿入也许还需要其他高亲和力受体存在,如单纯性疱疹病毒Ⅰ型感染成纤维细胞时,其特异性受体为生长因子受体,而HS则作为一个辅助分子起作用。以上研究均是在非人细胞系上进行的。对两株与DEN-2高度亲和的人白细胞系(髓单核细胞系HL60及非EBV转化的B细胞系BM13674)的研究也表明GAGs参与病毒-细胞间的相互作用,但不可能是唯一方式。Bielefeldt-Ohmann认为肝素是高度带电分子,它抑制DEN-2与细胞的结合可能是通过非特异性干扰VAP-细胞受体的相互作用而实现的。目前较为合理的解释是HS使登革病毒粘附至细胞上,粘附作用的增强还需要特异性高亲和力受体存在,并最终介导登革病毒进入细胞。登革病毒的另一类受体为病毒特异性IgG及IgM类抗体,抗体分子虽然不是细胞膜表面结构,但仍可作为一类十分特殊的病毒受体介导病毒的吸附和穿入。通常人及灵长类动物的单核巨噬细胞虽可感染DEN,但细胞只能有限度地支持病毒的繁殖。如在细胞培养过程中加入亚中和浓度的抗DEN单克隆抗体,可导致病毒的大量复制,通常病毒产量可增加20～1000倍,这种现象称为抗体依赖性增强作用(ADE)。其基本原理是:抗体的Fab段与病毒特异结合,而抗体的Fc段则与细胞表面的FcR结合,形成病毒-抗体-细胞复合体,从而介导病毒的感染,当然,ADE作用并不是登革病毒独有的,几乎所有的抗病毒表面抗原表位的抗体均有不同程度的ADE作用,其发生依赖于感染细胞表面存在的FcR。此外,补体受体(C3R)也能引起登革病毒感染增强作用。2病毒rna的形成DEN病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆,正链RNA合成的循环模板是复制型(RF)RNA,为双链RNA(dsRNA),在病毒复制周期中正链RNA大约是负链RNA的10～100倍。在DEN-2病毒感染细胞中可观察到病毒诱生的膜结构。通过免疫金标记及一系列的生化分析表明KUN病毒感染Vero细胞后,能诱生一系列独特的膜结构,病毒的复制复合体(replicationcomplex,RC)存在于膜泡群(vesiclepackets,VP),由dsRNA及NS1、NS2A、NS3、NS4A与NS5蛋白组成,此外,特异的细胞蛋白(如eF1-α可与3′NTR端的SL结构相互作用)也可能参与病毒的复制过程。黄病毒诱生的膜结构虽然早有报道,但长期以来对这些膜的细胞内起源及其在感染中所起的作用并不了解。最近采用免疫荧光及冷冻免疫电镜技术显示NS2B及NS3(病毒蛋白酶复合体)与NS4A共定位于诱生的卷曲膜(convolutedmembranes,CM)及次晶态排列(paracrystallinearrays,PC),而复制复合体定位于VP。其他蛋白如C蛋白及NS4B则与增殖的内质网膜相连,然后再转位至胞核。进一步对KUN病毒感染后的膜形成动力学进行研究,发现细胞内存在膜成分的重排,包括粗面内质网(RER)、中间腔(intermediatecompartment,IC)及反式高尔基体的膜成分。重排或诱生的结构具物理上的连接,并且在病毒复制周期中有各自明确的功能。正链RNA的翻译发生在RER,首先产生多聚蛋白前体,随后在ER腔进行信号肽的切割,CM及PC膜结构中存在的NS2B/NS3蛋白酶对大部分NS区蛋白的切割产生单个的NS蛋白,它们可仍然滞留于CM/PC(如NS2B、NS3及NS4A)内,也可进一步转运至VP(如NS1、NS3、NS5、NS2A及NS4A),或者移至胞核(NS4B)。病毒蛋白从RER向高尔基体的运动对膜的诱生是必需的,CM膜与PC膜可相互转换,它们均来自IC,而VP膜则诱生于反式高尔基体的膜成分。位于VP膜内的复制复合体又是如何形成并启动负链RNA的合成呢?这方面的研究得益于稳定的KUN感染性全长cDNA克隆FLSDX的建立及能永久表达KUN病毒复制子RNA的BHK细胞系repBHK的建立,前者使突变基因的引入变得容易,后者则有利于反式互补作用的研究。KUN病毒复制子RNA为缺失了病毒的大部分结构区基因(仅保留了C蛋白的前60个核苷酸)的亚基因组RNA,能在转染细胞中复制,这说明RNA的复制只需NS蛋白即可。对黄病毒NS1蛋白亚细胞定位显示大部分NS1紧密结合在病毒诱生的VP膜上,Muglaert等进一步证实了YFV-NS1温度敏感突变株能阻断其基因组RNA的扩增。黄病毒NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶(serineprotease)活性及核苷三磷酸酶活性(nucleosidetriphosphatase,NTPase)、RNA解旋酶活性(RNAhelicase),前者的功能结构域位于NS3蛋白N端的1/3区,主要负责多聚蛋白的翻译后加工,产生成熟的病毒蛋白,这是病毒自我复制和组装的前提条件;后者的功能域位于C端的2/3区,主要参与病毒RNA的复制过程。黄病毒NS5蛋白具有非特异性RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,包括8个保守的RdRp序列,其中之一为GDD序列(Gly-Asp-Asp),另有2个保守的具甲基转移酶特性的MT序列,在全长cDNA克隆FLSDX中分别缺失GDD序列和一个MT序列(S-腺苷甲硫氨酸位点),产生FLdGDD、FldSAM构建体,将它们的体外转录本导入BHK细胞,结果这些RNAs完全失去复制能力,可见GDD序列及MT序列对NS5功能的发挥是必不可少的。如果将它们的体外转录本导入repBHK细胞,则可产生仅能在repBHK细胞中复制的缺失病毒。这是因为repBHK细胞内能稳定产生辅助复制复合体,缺失GDD及MT序列形成的缺失型复制复合体能与辅助复制复合体有效地交换成分,其中的辅助NS5可结合至缺失RNA模板启动复制。通过对KUN病毒NS5基因的进一步缺失研究表明,将感染性全长cDNA克隆NS5基因羧基端5%、34%、56%的区域缺失后,体外转染repBHK细胞,均有缺陷病毒分泌,其中将NS5基因羧基端缺失56%的构建体缺失了全部的RdRp区。而将缺失NS5基因氨基端的构建体转染repBHK细胞后,NS5的功能不能被有效互补。通过比较黄病毒NS5蛋白N端的氨基酸序列,找到了3个高度保守区:a区(141～151氨基酸),b区(203～223氨基酸),c区(343～365氨基酸),这3区缺失的RNA不能在repBHK细胞复制。由此可以设计一个这样的复制模型(图1,2):在翻译过程中,黄病毒NS5蛋白的N端通过保守序列(a区、b区、c区)与NS3和NS2A相互作用,于基因组RNA的3′NTR启动复制复合体的形成。然后RNA模板与已形成的不成熟复制复合体运输至VP膜上某个锚定区,以形成完整的复制复合体,并在此处启动负链RNA的合成。复制复合体一旦形成即以活性状态稳定存在,不需要新翻译的NS蛋白的补充。NS2A的作用可能是将病毒的RNA及复制复合体靶向VP膜,NS4A是一个跨膜蛋白,以二聚体形式存在,NS1与NS4A的腔内部分直接结合,可诱导NS4A的构象发生变化,然后NS4A及NS2A通过疏水相互作用结合,形成的完整复制复合体发生结构重排,使其中NS5的RdRp区与正链RNA结合,启动负链RNA的合成。根据上述推测的复制模型可以看出,缺失NS5蛋白的C端并不阻止它与其他NS蛋白的相互作用,但最终形成的是缺陷型复制复合体。通过互补实验发现缺陷型复制复合体仍能将缺失了NS5基因C端的RNA运送至repBHK细胞内辅助复制复合体合成位点,此过程可能由NS2A引导。缺陷型复制复合体通过与辅助复制复合体或其中成分交换,从而启动缺失了NS5基因C端的负链RNA合成。该模型是否真实反映了黄病毒的复制事件尚需进一步的实验证实。3检查病毒几何质量及重组病毒颗粒DEN病毒的核衣壳由衣壳蛋白C及基因组RNA构成,其中C蛋白含大量的Lys和Arg残基,这些碱性氨基酸可部分中和RNA的负电荷。使用DEN-2及DEN-4衣壳蛋白C的单克隆抗体可检测到C蛋白存在于感染细胞的胞浆、胞核膜及核内,目前对C蛋白具有的核定位位点重要性及其与病毒形态发生的关系尚不清楚。DEN病毒组装的第一步发生在ER膜相关位置。C及PrM蛋白连接处的内部信号序列指导prM蛋白穿越ER膜并定位于ER腔。NS2B/NS3催化C蛋白羧基端在胞浆侧的切割,此过程使以隐蔽构象存在的prM信号肽在转位通道前后作布朗运动,然后被位于ER膜腔侧的信号肽酶识别。同样prM-E连接处的切割也由ER内的信号肽酶介导。如果将prM信号肽的羧基端用理想的信号肽酶识别序列VPQAQA取代,可使C-prM连接处无需先经NS2B/NS3在胞浆切割,信号肽酶即可发挥作用,结果发现信号肽酶对prM的切割功能的确加强了,同时感染性病毒颗粒的产量也大大降低。进一步研究表明,VPQAQA突变体并不影响病毒复制的早期过程(病毒RNA及蛋白质合成),可能影响的是发生在ER膜上黄病毒的组装。该突变体导致C蛋白以膜锚定形式存在,可能它不能作为NS2B/NS3的底物,这对病毒的组装影响极大,因为锚定蛋白是病毒粒子C蛋白的前体,前者向后者的转换可启动核衣壳在胞浆的组装。DEN病毒粒子组装的第二步是形成一个未成熟颗粒,E蛋白与prM蛋白非共价相连成异源二聚体,其中prM起伴侣分子的作用,可阻止未成熟病毒颗粒在通过酸性膜泡分泌过程中,E蛋白构象发生不可逆变化。随后prM蛋白内部,受宿主弗林蛋白酶(furin)的切割,裂解产生M蛋白,引发病毒颗粒表面的E蛋白形成同源二聚体,最终产生成熟的病毒颗粒。只有含M蛋白的病毒颗粒才能介导病毒与细胞间在酸性pH条件下的融合。初步认为登革病毒颗粒组装过程如下:在蛋白合成过程中E、prM插入RER膜;C蛋白与病毒的RNA在胞浆中装配成核衣壳,并集中于ER膜的细胞浆侧。核衣壳可能通过芽生方式获得包膜,非成熟病毒颗粒在内质网组装,然后进一步转运到反式高尔基体,对E蛋白及prM蛋白的糖侧链进行加工,通过细胞分泌途径运输至胞外。在释放前,prM裂解产生M蛋白,E蛋白同源二聚体化形成成熟的病毒颗粒。登革病毒prM、E蛋白糖侧链的加工对病毒糖蛋白的正确折叠有重要意义。DEN-