丹红注射液对大鼠动脉血管扩张作用及其机制研究

丹红注射液对大鼠动脉血管扩张作用及其机制研究

丹参红注射液以丹参和红花为主要成分，采用现代工艺科学制备的复方制剂。主要疗效包括丹参酮、丹参酸、丹参酚酸、红景天、红花酚酸、儿茶酚等。血液扩散、舒脉、舒络脉象。临床上将其应用于动脉粥样硬化、心肌梗死等心脑血管疾病的治疗,可以明显缓解脏器组织供血不足、改善血液流变学指标。然而,目前对于丹红注射液治疗作用的研究多为临床资料,对于丹红注射液发挥临床治疗效果的药理学基础则知之不多。因此,本研究拟以大鼠在体后肢灌流模型和离体大鼠腹主动脉环为模型,观察丹红注射液舒张血管的作用及其机制,为丹红注射液治疗微循环等疾病提供理论参考。1材料表面1.1大器、张力换能器PowerLab数据记录和分析系统,包括软件Chart510以及硬件8通道桥式放大器(ADInstrumentsCo.,Australia);FT03C张力换能器(GrassInstrumentCoQuincy,Mass,USA);Myograp恒温浴漕(DMT,Denmark);体视显微镜(NikonSMZ-1500)。1.2甲磺酸酚妥拉明注射液丹红注射液(菏泽步长制药有限公司,批号090114,规格:10mL/支);重酒石酸去甲肾上腺素注射液(NE,上海禾丰制药有限公司,批号100302,规格:2mg∶1mL);甲磺酸酚妥拉明注射液(上海旭东海普药业有限公司,批号100601,规格:10mg∶1mL);阿托品(天津药业,批号1002271,规格:0.5mg∶1mL);咖啡因(caffeine,熔点标准品,陕西省药品检验所馈赠);四氨基吡啶(4-Ap)(Sigma公司,批号A3858)和四乙胺(TEA)(Sigma公司,批号akeasci96203)。1.3体质量与动物Sprague-Dawly(SD)大鼠80只,体质量(180～220)g,♀♂兼用,由西安交通大学实验动物中心提供,合格证:SCXK(陕)2007-001号。2方法和结果2.1统计方法实验数据除特殊标注外,其余均以x¯±sx¯±s表示,组间均数的两两比较采用t检验。2.2灌流液体积测定将乌拉坦(1g·kg-1,ip)麻醉的大鼠置于实验台固定,沿腹部正中切开,分离腹主动脉与静脉,在肾血管水平向远心端插管,并结扎近心端。腹主动脉插管灌注37℃氧饱和的Krebs灌流液,调节灌流压至50mmHg,平衡0.5h后,依次用含有不同浓度药物的灌流液灌流,经腹主静脉插管回收灌流液,测定单位时间内回收灌流液的体积。更换药物前,均用空白灌流液平衡灌流0.5h,使灌流速度恢复至用药前水平。以空白灌流液平衡状态下的灌流速度作为100%,计算在同一标本上药物灌流时的相对流速。相对流速=含药灌流液灌流流速/空白灌流液灌流流速×100%2.2.1统计学意义:“0.0.052.5”5在体灌流试验结果显示,阳性对照药1×10-5mol·L-1阿托品可增加大鼠后肢血管灌流速度174%,具有非常显著的统计学意义(P≤0.05);丹红注射液在灌流量0.1,0.3,1.0,3.0mL·L-1时,平均相对灌流速度增加最大未超过10%,均无统计学意义,仅在高灌流量(30mL·L-1)时对平均相对灌流速度增加了33%,具有统计学意义(P≤0.05)。2.2.2krebs液冲洗前后高钾预收缩血管速度比较以Krebs液冲洗平衡标本,再用含30mmol·L-1KCl的Krebs液灌流40min,使血管预收缩至稳定状态,随后观察在高钾条件下,不同浓度丹红注射液对灌流速度的影响。结果显示,在正常Krebs液冲洗平衡的标本中加入KCl后,灌流速度有明显降低,平均相对流速降低到正常灌流的48%(P≤0.01);阳性对照药异丙肾上腺素(1×10-5mol·L-1)可使高钾预收缩的血管平均相对灌流速度提高80%,显著对抗高钾所引起的灌流速度降低(P≤0.01)。0.3,1.0,3.0mL·L-1丹红注射液可使平均相对灌流速度分别提高到115%,112%和127%,但仅3.0mL·L-1流量组与高K+组模型对照组差异具有统计学意义(P≤0.05)。2.2.3l-4丹红注射液的抗菌材料如表1所示,对于NE所引起的大鼠后肢灌流速度明显降低,0.3～3mL·L-1流量的丹红注射液均表现出了显著的拮抗效果(P≤0.05)。2.3丹红注射液及kras对大鼠腹主动脉血管的张力及相关效应的变化大鼠断头处死后迅速取出动脉血管,浸入冷Krebs液中在显微镜下剥离血管周围组织。以Ach(1×10-5mol·L-1)检验内皮功能,若舒张率>75%则表明内皮完整,舒张率<10%则显示内皮已被完全去除。用于去内皮试验的血管标本在实验前用0.1%的TrintonX-100灌注5s,然后再用Krebs液灌注10s。将处理好的血管剪成1mm长的动脉环,套在2个L型的金属针上,一端连接FT03C张力换能器,另一端连接调节负荷张力的微调装置,并将连接好的动脉环置于37℃恒温氧饱和的Krebs灌流液中。实验前,调节动脉环静息负荷至2mg·L-1,每2分钟换液1次,稳定1.5h。以K+-Krebs液(含60mmol·L-1K+)检验动脉环收缩性,2次收缩幅度变化小于10%的标本用于实验。用四乙胺(TEA)或四氨基吡啶(4-Ap)预孵育0.5h后,以NE(1×10-6mol·L-1)预收缩血管,收缩稳定后累加浓度法加入丹红注射液或等体积灌流液,对比观察药物的作用。标本平衡灌流待基线稳定后,浓度累加法加入丹红注射液或Krebs液平行操作,观察在0.3,1.0,3.0,10,20,30,40mL·L-1系列浓度下丹红注射液对正常大鼠腹主动脉血管环基础张力的影响。结果显示,在3～40mL·L-1范围内,丹红注射液舒张血管作用表现出统计学意义(P<0.05),但血管平均张力降低幅度与空白对照组相比均不超过12%,表明其对正常血管的张力幅度影响较小。以1×10-6mol·L-1浓度NE预收缩血管,稳定后浓度累加法加入丹红注射液或空白对照Krebs液。如图1所示,在观察的0.3～40mL·L-1范围内,丹红注射液可浓度依赖性地舒张NE预收缩含内皮(P<0.01)和去内皮(P<0.01)的血管环。虽然内皮完整的主动脉环的舒张效应与去内皮血管环的舒张效应之间未发现有显著性差异(P>0.05),但相对于各自的空白对照组,在3～40mL·L-1下,2组相对张力降低的幅度之间存在明显性差异(P<0.05)(见图2)。其中:相对张力降低的幅度=给药组相对张力-对照组相对张力。上述结果表明,丹红注射液对腹主动脉血管环的舒张除通过平滑肌起作用外,内皮细胞也发挥一定的作用。内皮完整的腹主动脉血管环,稳定灌流1.5h,加入KCl(终浓度60mmol·L-1)稳定40min后,累积法依次加入丹红注射液或空白对照Krebs液。如图3所示,丹红注射液可舒张KCl预收缩的血管环,且呈浓度依赖性(P≤0.01)。腹主动脉环平衡灌流1.5h后,用K+(60mmol·L-1)检验血管活性,合格后分别以四乙胺(TEA)1×10-3mol·L-1或四氨基吡啶(4-Ap)1×10-4mol·L-1预孵育内皮完整的腹主动脉环0.5h,加入1×10-6mol·L-1浓度NE预收缩大鼠腹主动脉,稳定后按浓度梯度法加入丹红注射液或空白对照Krebs液,对比观察丹红注射液的血管舒张效应。计算相对张力降低幅度。相对张力降低幅度=对照组相对张力值(%)-丹红组相对张力值(%)结果如图4和图5所示,无论钾离子通道阻滞剂TEA或4-Ap存在与否,NE对腹主动脉的收缩作用均无明显变化,显示TEA和4-Ap对NE收缩腹主动脉的作用均无明显影响。在TEA或4-Ap存在下,与空白对照组相比,丹红注射液均可显著性拮抗NE引起的血管收缩(P<0.01);TEA和4-Ap对丹红注射液引起的血管舒张的相对张力降低幅度均无明显影响(P>0.05)。因此,在腹主动脉上钾离子通道阻滞剂TEA和4-Ap对丹红注射液拮抗高NE血管收缩的作用均无明显影响,提示在腹主动脉上丹红注射液舒张血管的作用可能与钾离子通道无关。内皮完整的腹主动脉血管环,平衡1.5h后,用无钙Krebs液(正常Krebs液中无CaCl2并加入Ca2+络合剂1×10-4mol·L-1EDTA)孵育5min,以此作为无钙灌流平衡张力100%,然后加入1×10-6mol·L-1的NE,可见动脉环产生迅速而短暂的收缩,计算相对张力;继续灌流待张力平稳,作为后续复钙灌流的100%,加入1×10-3mol·L-1的CaCl2,可见动脉环再次收缩并达峰值,计算复钙灌流的相对张力。然后用Krebs液反复冲洗5次,平衡45min,加入无钙的Krebs液的同时加入20mL·L-1的丹红注射液作用5min,重复上述实验。观察丹红注射液对无钙Krebs液中NE或CaCl2缩血管效应的影响。结果如表2所示,在无钙灌流条件下,丹红注射液对血管平滑肌收缩的抑制作用较弱,显示其对平滑肌细胞内钙释放影响较小;含钙灌流液复灌后,丹红注射液对动脉血管收缩的抑制作用较强,且具有非常显著性统计学意义(P<0.001),提示丹红注射液的血管舒张作用可能主要与阻滞外钙内流有关。内皮完整的腹主动脉血管环,于无钙Krebs液中平衡,以此张力作为100%。于无钙Krebs液中加入30mmol·L-1咖啡因,可见动脉环产生迅速而短暂的收缩,计算相对张力。再在无钙Krebs液中加入20mL·L-1丹红注射液,重复上述实验。结果显示,咖啡因引起空白对照组和丹红组血管环收缩的相对张力分别为(129±10)%和(146±21)%,两者间并无统计学意义(P>0.05)。3丹红注射液的血管扩张作用本次研究结果发现,丹红注射液对正常灌流条件下大鼠在体血管流量和高浓度钾离子引起大鼠组织血管流量减少的影响较小,仅在较高浓度下对大鼠后肢灌流有轻度的增加作用;对高NE引起的大鼠组织灌流减少有非常显著的拮抗作用;可明显舒张由NE收缩的在体血管直径。交感神经兴奋和循环血液中的高儿茶酚胺状态既是引起组织血液灌流减少和微循环障碍的重要原因之一,也是中医上“血淤”发生的重要的病理学基础。因此,这一观察结果提示,拮抗高NE的缩血管效应可能是丹红注射液改善组织血流供应和微循环以及发挥“活血化淤”功效的重要途径。为探讨丹红注射液舒张血管的作用机制,本研究选择了较大的腹主动脉作为观察对象,采用大鼠离体腹主动脉环研究模型。结果发现,无论是内皮完整的还是去内皮的血管环,丹红注射液都可以拮抗NE引起的血管收缩,其中内皮完整血管的舒张幅度稍高于去内皮血管,从而提示丹红注射液的舒张血管作用部分可能通过内皮细胞发挥作用。KCl可以激活电压依赖性钙通道,导致细胞外钙内流而引起动脉环收缩。丹红注射液能够舒张KCl预收缩的动脉环,提示丹红注射液可通过抑制电压依赖性钙通道,阻止钙内流而起到舒张血管的作用。钾离子通道阻滞剂TEA和4-Ap对丹红注射液拮抗高NE收缩血管的作用均无明显影响,提示丹红注射液扩张血管作用与其影响钾通道关系不大。NE和咖啡因均为平滑肌钙通道研究的工具药物。在无钙液灌流条件下,NE和咖啡因均可通过促进平滑肌细胞内Ca2+释放而引起血管快速而短暂的收缩;在含钙液灌流条件下,NE能够通过激活细胞膜上的受体操纵钙通道增强外钙内流,诱发血管收缩。细胞内Ca2+释放通过IP3和Ryanodine2种受体–Ca2+释放途径。本次实验发现,丹红注射液对于无钙灌流条件下咖啡因引起的动脉血管平滑肌收缩的抑制作用影响较小或未见有抑制作用,提示丹红注射液发挥作用主要通过抑制IP3受体中介的钙释放,而对Ryanodine受体途径没有影响。对于无钙灌流条件下NE引起的动脉血管平滑肌收缩的抑制作用在腹主动脉上未见明显影响;对含钙灌流条件下NE诱发血管收缩有显著的抑制作用,从而提示丹红注射液可能主要通过抑制经受体操纵钙通道的外钙内流发挥血管舒张作用。综上所述,丹红注射液对高NE引起的大鼠组织血液灌注减少和微循环降低有明显的改善作用;丹红注射液可拮抗高NE和高钾(其中主要是高NE)所引起的血管平滑肌收缩;内皮细胞在丹红注射液的血管舒张作用中发挥一定作