温度对离体条件下尿酸盐结晶沉积的影响

温度对离体条件下尿酸盐结晶沉积的影响

高尿酸血症患者中的疼痛风性关节炎发生率仅为10%20%，其原因尚不清楚。主要问题是不知道是什么使得关节腔中的钠胺结晶积聚。本实验室曾建立了持续性高尿酸血症模型,虽然造模后血清尿酸水平持续升高,但几乎未见动物有类似关节炎的表现。根据临床痛风性关节炎患者发病特点,本室对持续性高尿酸血症模型大鼠附加冷水游泳条件,结果可见,高尿酸血症模型大鼠关节出现明显肿胀。为了解释这一现象,探索高尿酸血症并发痛风性关节炎的病理生理机制,借助体外试验方法,选取人工关节液为研究基质,通过调整温度,观察尿酸在人工关节液中形成结晶的情况。通过大鼠离体后肢灌流试验,进一步考察在离体条件下,温度对关节腔中尿酸浓度的影响。1材料和方法1.1酸、肝素钠注射液尿酸酶抑制剂(uricaseinhibitor,UI),Sigma-Aldrich公司,批号:S27869-095;次黄嘌呤(Hypoxanthine,HX),南京鼎润生物技术有限公司,批号:20060312;玻璃酸钠注射液(即:人工关节液),山东博士伦福瑞达制药有限公司,批号:08121702;尿酸,ICNBiomedicalsInc,批号:103215;尿酸试剂盒,上海复星长征医学科学有限公司,批号:D090271;肝素钠注射液,中国江苏常州千红生化制药有限公司,批号:060927。洛氏液配制:洛氏液(g/L)组成成分(氯化钠9.0氯化钾0.42氯化钙0.24碳酸氢钠0.15葡萄糖2.27),用新鲜蒸馏水溶解,碳酸氢钠先溶解后再逐滴加入已溶好的氯化钙中,边加边振荡,以免产生混浊。临用前加入葡萄糖。将不同重量的尿酸固体分别加入到洛氏液中,调pH至7.4,放入37℃水浴中待完全溶解,分别得到UA浓度为500μmol/L、1000μmol/L、1600μmol/L的尿酸溶液。1.2实验动物清洁级大鼠,体重300±20g,雄性。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,实验动物饲养许可证号为:SCXK(沪)2007-0005。1.3ph/mv/测定方法日立-7020全自动生化分析仪,日立仪器(苏州)有限公司。HSS-1(B)型恒温浴槽,成都仪器厂。HI8424NEW便携式防水型Ph/mV/℃测定仪,北京哈纳科仪科技有限公司。偏光显微镜AxioImagerM1,德国蔡司仪器有限公司。1.4方法1.4.1尿酸浓度的影响参照文献资料,制备大鼠高尿酸血清,全自动生化分析仪测定血清UA值,获得UA浓度为2400μmol/L的血清,备用。将人工关节液5ml在室温25℃静置10min,测PH为7.5。取正常人工关节液3份,每份0.5ml,分别加入0.25ml高尿酸血清,在高速混匀机上震荡2min后,制备出尿酸浓度为800μmol/L的人工关节液溶液,分别放入37℃、32℃、27℃恒温浴槽中,水浴48h后,测各组关节液中UA,考察尿酸浓度为800μmol/L的人工关节液溶液在不同温度的影响下,尿酸浓度的变化。另取人工关节液各10μL涂片,在光学显微镜下(×400)观察是否有结晶生成,根据结晶数目评分。每张涂片随机取3个视野,以3个视野结晶数的均值作为评分的依据,见表1。1.4.2离体标本的分离和纯化参考文献资料,大鼠腹腔注射肝素5mg/kg,15min后,以10%水合氯醛麻醉,固定,打开腹腔,找到直肠,双道结扎,于两结扎线间剪断。移去肠管,可见腹主动脉和下腔静脉。在肾血管水平仔细找到肠系膜上动脉(相当于肾血管水平,由腹主动脉分出向左行走);在腹主动脉分为二髂总动脉处找到肠系膜下动脉(由靠近左髂总动脉处分出),分别结扎并剪断。分离腹主动脉和下腔静脉,于肾血管水平以下的腹主动脉和下腔静脉下各预置二线,结扎近心端,分别向腹主动脉和下腔静脉的远心端插管,扎紧,固定。向腹主动脉套管中注射肝素,下腔静脉套管中流出,防止插管中血液凝固。剪断脊髓等上半身组织,先用注射器把灌流液注入套管,冲洗血管内的血液,直至流出液澄清为止。然后将腹主动脉套管与恒压灌流装置相连,将标本固定于鼠板上,使灌流液流速保持在0.5ml/min,将下肢流出的灌流液经下腔静脉套管引至一容器收集。将两后肢分别插入控制好温度的U形浴槽中(浴槽的外槽内盛有自来水),经由HSS-1(B)型恒温浴槽使水温保持在20℃、27℃、37℃。将离体标本随机分为空白组、低、中、高浓度组,每组6只。分别用洛氏液、浓度为500μmol/L、1000μmol/L、1600μmol/L的尿酸溶液灌流,灌流液中含95%氧气和5%二氧化碳,温度为37℃。灌流3h后,打开关节腔,取关节液(以0.1ml生理盐水反复冲洗10次),测UA浓度。2结果2.1h7.5时,27组的ua值结果见表2、表3。结果表明,水浴48h,pH7.5时,27℃组的UA值显著低于37℃组(P<0.01)。32℃组和37℃组均有三例可见少量结晶,27℃组有三例结晶明显增多。2.2灌流液中尿酸浓度对膝关节腔中ua值的影响结果表明,温度对空白组动物关节腔中尿酸浓度没有影响。各组随着温度的降低,关节腔中UA值有所上升,环境温度为20℃时,各组动物关节腔中UA值明显高于环境温度为37℃时的浓度,有显著性差异(P<0.01);环境温度为27℃时,中、高浓度组关节腔中UA值高于环境温度为37℃时的浓度(P<0.01,P<0.05)。灌流液中尿酸浓度对关节腔中UA浓度有一定的影响,高、中浓度组在各环境温度下,关节腔中UA值均高于空白组,有统计学差异(P<0.01,P<0.05);低浓度组在环境温度降至20℃时,UA值显著低于空白组(P<0.01)。3血尿酸选用的温度和灌流条件与关节腔温度的关系众所周知,高尿酸血症是痛风发作的必要条件,但是许多患者尽管高尿酸血症存在多年,却并未发生痛风性关节炎,可见高尿酸血症痛风性关节炎的发生一定还存在着其他影响因素。究竟在什么条件下可诱发痛风性关节炎,临床上提出了许多可能的原因,如过量摄取高脂高蛋白饮食、食用豆制品或海鲜、饮酒、受寒冷潮湿等。许多研究者为此提出了各种学说,如蛋白多糖学说和创伤及其他影响因素说等等,可见究竟是什么原因导致痛风性关节炎的发生其实并不十分清楚。本课题组曾对临床痛风性关节炎患者的发病特点进行了深入的分析和总结,此类病人常在夜间发病,发作的部位多为四肢末梢。通常夜间温度较低,肢端更易于受低温环境影响而发生微循环障碍,一般末梢部位温度较中心可低5度左右。而本实验室通过在持续性高尿酸血症模型大鼠附加冷水游泳条件,亦可见模型大鼠关节出现明显红肿,较接近临床痛风性关节炎患者发病时关节的表现,故认为血尿酸沉积关节腔与局部温度联系密切。临床痛风性关节炎患者血尿酸浓度一般在450～1000μmol/L之间波动,本实验将温度作为考察条件,以人工关节液作为基质,对尿酸浓度为800μmol/L的人工关节液中UA浓度及尿酸盐结晶形成的进行了考察。结果表明,低温更有助于尿酸盐结晶析出增多,由于尿酸向尿酸盐结晶转化,关节液中尿酸浓度明显降低,这一现象解释了临床有些痛风性关节炎患者为什么发病时血清尿酸浓度并不是很高。大鼠离体后肢灌流试验中,为较好的保持离体后肢的生理活性,灌流时间设为3小时,灌流时间虽然较短,但随着环境温度降低,向关节腔中转移的尿酸浓度有所增加,且与灌流液中尿酸浓度有关,随着灌流液中尿酸浓度的增加,转移入关节腔中尿酸浓度也升高,此变化为尿酸盐沉积在关节腔形成结晶奠定基础。基于本试验研究结果,我们认为当机体维持在高血尿酸水平时,低温