我国登革病毒病毒检测及研究进展

我国登革病毒病毒检测及研究进展

病毒登甲炎是病毒登甲炎的一种病原体。它属于黄毒科黄毒科。根据抗原性的不同,登革病毒分为1、2、3、4四个血清型。登革热是一种由伊蚊传播的急性传染病,在临床登革热可分为登革热(denguefever,DF)和登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)/登革休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS)两个类型。前者病情较轻,后者病情较重,致死率高。近年来登革热及登革出血热在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已造成严重的威胁。登革热在我国销声匿迹数十年后又卷土重来,在1978年广东佛山首先爆发流行,以后在海南、广东、广西、福建、台湾、香港、澳门等地均有流行或爆发流行,据报道全球约25亿人口受到登革病毒感染的威胁。登革病毒引起DHF/DSS的机理目前仍然存在争议。主要有两种假说:一是二次感染假说,又可分为RUSSEL等提出的过敏理论和HALSTEAD提出的感染中依赖抗体增强作用(antibodydependentenhancementofinfection,ADE)。这一假说认为DHF是由于第一次登革病毒感染五年内又获异型病毒的二次感染,尤其是DEN-2的感染,新感染病毒作为抗原和原有抗体结合形成抗原抗体复合物,激活补体系统产生过敏毒素,或提高单核细胞吞噬作用,使病毒能进入单核细胞内增殖,产生免疫增强作用。第二种假说是ROSEN提出的强毒力病毒理论,该理论认为DHF/DSS的发生是受一种毒力更强的登革病毒株的感染,近年来强毒力病毒理论获得了一些直接证据,越来越受到研究者的重视。本文主要针对第二种假说,对登革病毒基因组核苷酸变异与毒力关系的研究进行综述。1基于大力事实的登革病毒pcr检测登革病毒的基因组为一单正链RNA分子,长约11kb。其基因组的5′端有I型帽子结构m7G(5′)ppp(5′)Amp,3′末端为CU-OH,没有多聚A结构。目前登革病毒4个型别的基因组RNA全序列已经测定。cDNA序列分析表明,登革病毒RNA的5′端和3′端各有1段非编码区,中间是仅有的一个长的开放读码框架ORF,基因组约96%的核苷酸序列在此框架内。该ORF可分为两部分:5′端1/4的序列编码病毒的3种结构蛋白(核心蛋白C、膜结合蛋白前体PrM和包膜蛋白E);3′端3/4的序列编码病毒的7种非结构蛋白(NS)。编码结构蛋白与非结构蛋白的基因次序为:5′-C-PrM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。2革命毒的毒力控制2.1白都体诱导的检测目前认为,登革病毒毒力是多位点控制的,并非只有一个毒力因子发挥决定或主导作用。核苷酸的变异在基因组序列内是随机分布的,而不是密集在特定区域内。登革病毒毒力的变化是通过不同机制引起的,如5′和3′非编码区核苷酸一级结构和二级结构可能在病毒的复制周期参与必要的调节功能,因此在非编码区核苷酸序列的突变可干扰病毒的转录和复制。E和M(或它的前体,PrM)结构蛋白都能介导中和抗体的保护性免疫反应,NS1也是一个保护性抗原,在RNA复制中起重要作用。单个氨基酸的变化往往就能影响这些蛋白的功能,从而影响毒力。目前主要通过比较强、弱毒株核酸序列的差异,发现登革病毒毒力相关位点,而减毒株获得的途径主要有以下五类:一、在敏感细胞上连续传代获得的突变株。登革病毒可在多种原代和传代细胞上增殖并产生细胞病变作用和空斑,如BHK21、HeLa、KB、Vero、LLC2MK2、FRhL和C6P36等。而较多文献报道的是通过在原代狗肾细胞(PDK)中连续传代,获得对人体减毒株。二、在宿主动物体内繁殖和传代获得的突变株。将登革病毒在鼠脑连续传代,使之适应在鼠脑中生长,可获得高生长滴度的病毒和乳鼠神经毒力突变株。三、定位点突变和缺失突变获得的突变株。重组DNA技术是一种具有极高效率的产生突变方法,且理论上可产生各种可能的突变,这样就能对某一特定区段DNA的功能进行更为细致的研究。定位点突变技术目前主要应用于研究编码区序列与毒力的关系。四、从不同症状病人中分离的不同毒株的序列比较。从不同症状病人中分离的野生毒株的序列比较在登革病毒毒力研究应占据重要地位,但所采用的测序毒株在细胞或动物中传代次数要尽可能的少。五、对具有已知功能的基因组序列直接突变获得的突变株。2.2非结构蛋白编码区对毒力的影响当前对DEN病毒的毒力位点研究的比较多的区段有prM、E、NS1、NS3及5′、3′NTR,目前发现的登革病毒的毒力位点大多在E区,PrM和NS1区也有涉及,C区氨基酸序列则趋于保守。多项实验表明非结构蛋白编码区对毒力有影响,5′和3′非编码区某些区段缺失严重影响毒力。下面分别对这几个区段的毒力位点研究结果作出阐述。2.2.1prm蛋白通过对den病毒的检测形成prM蛋白为病毒粒子的组成成分,为M蛋白的前体,在病毒成熟的过程中,prM蛋白经特定酶切后形成一个相对分子质量为8000的M蛋白。M蛋白的形成可增强病毒的感染性,并与其他DEN蛋白共同形成病毒粒子的表面结构,prM蛋白还与病毒的装配成熟有关。动物实验表明,prM蛋白能被动保护同型及异型DEN病毒攻击,但prM单抗无中和活性。通过对prM的抗原性预测表明其28位及31位氨基酸所带电荷很重要,D2-16681株与16681-PDK53株prM的第28位氨基酸由Asp(16681)→Val(PDK53),由带负电荷的氨基酸变异为不带电荷的氨基酸而减毒。2.2.2盐藻den重组病毒的毒副反应E糖蛋白存在于登革病毒粒子的表面,是主要的病毒抗原,它可通过诱发中和抗体产生保护免疫反应,阻断病毒与细胞的融合,登革病毒的毒力基因大多在E区。目前认为登革病毒E蛋白中影响毒力的3个区段是:(1)Ⅲ区(残基303~395),此区的突变影响病毒进入细胞和细胞嗜性;(2)Ⅱ区(残基52~136和190~284),此区的改变会影响病毒的促融合活性;(3)Ⅱ区和Ⅲ区分界面之间的区域(294~305)。E糖蛋白在病毒的吸附、酸性pH介导的病毒特异性膜融合及组装过程中都具有很重要的作用。DEN-2病毒E蛋白的390位氨基酸由酸性的Asp突变为中性的Asn或碱性的His往往会导致毒力升高,对此位点与毒力的关系有两种解释:通过对包膜糖蛋白的分析显示E-390位于蛋白表面的高度亲水区,390位残基所带电荷对此区的抗原与抗体的相互作用至关重要。其次E-390位于与宿主细胞受体结合区域(E284-310,E386-411)Asp→Asn的突变也许增强了DEN-2病毒对细胞的吸附。此外E126位于E蛋白三维结构Ⅱ区二聚体平面向外延伸的d-e环的最上方。d-e环由带正电荷的氨基酸占据,Glu→Lys使d-e环中唯一的带负电荷的氨基酸变为带正电荷氨基酸,这一电荷变化可能改变了病毒和细胞间的相互作用,引起病毒对小鼠神经毒的改变。LOK等发现DEN-2中和逃逸株MAb6B2在prM蛋白第15位及E蛋白(E311)处有氨基酸的改变,其中在E蛋白的改变位点与之前发现的E蛋白上被IgG识别并与抗体中和相关的表位(E307,E383-385)相邻;DEN-2中和逃逸株MAb10F2也同样在prM蛋白第15位处有氨基酸改变(Gly→Ser),同时在E蛋白处还有4个氨基酸替换(E69,Thr→Ile;E71,Glu→Asp;E112,Ser→Gly;E124,Ile→Asn),可以逃避10F2中和作用的突变,使病毒失去了与伊蚊细胞融合的能力,且更容易失活。有学者对一株在1989年分离到的南美DEN-1型病毒株FGA/89进行了研究,此病毒株采自于一位在1989年患登革热的妇女,被认为是一株由两种DEN-1病毒亚型重组得到的单一重组病毒株的后代,他们把FGA/89注射到乳鼠脑内生长,得到了有神经毒性的变异毒株FGA/NAd1d,然后对FGA/NAd1d的全基因组测序,并与FGA/89作比较。结果发现FGA/NAd1d在E蛋白处发生了3处氨基酸替换(E196Met→Val,E365Val→Ile,E405Thr→Ile),在NS3蛋白处发生了一处氨基酸替换(435Leu→Ser),这些位点发生的氨基酸替换很可能导致了FGA/NAd1d神经毒性的产生。方美玉等对广东省90年代以来流行的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白进行研究,发现这3株DEN2型病毒生物学实验证实均具有乳鼠神经毒力,根据国内外已发表的相关毒力位点,结合他们对3株DEN2型病毒结构蛋白基因测序结果进行比较分析表明,在PrM蛋白基因有报道的相关毒力位点上,164位应由Ile变为Ser,16位应由Arg变为Ile,而在这3株DEN2病毒中164位为Thr,16位为Leu,与文献报道不符;在E蛋白基因有报道的相关毒力位点上,3株病毒E126、E390、E62及E71位点与报道不符,而E383~385及E203位点与文献报道基本相符。在E126应由Glu→Lys毒力增强,得到较多学者的认同,但在实验中的3株DEN2均具有乳鼠神经毒力,但其E126位均为Glu,其它一些相关毒力位点也不尽相同。方丹云等在广州地区登革热患者91份血清中经2~3次传代分离出8株病毒,鉴定为登革1型病毒,其中两分离株在E蛋白影响毒力的3个区段中有3处存在变异,E88由Ala→Thr、E297由Met→Val、E339由Thr→Ser。推测此次广州地区登革热流行株的毒力减弱可能与其基因位点变异有关。2.2.3ns1蛋白的突变NS1蛋白为糖基化的非结构蛋白,表达在感染细胞内部或表面,也有一部分分泌至胞外,是病毒复制复合体不可缺少的组分,在NS蛋白中较为保守,一般Asn-连接的糖基化位点及12个Cys残基均保守。单体的NS1合成后具较强的亲水性,不久就形成二聚体,亲水性位点往往埋藏在二聚体内,因此疏水性有所增强。只有二聚体形式的NS1蛋白才能发挥其功能。引起电荷变化的氨基酸变化往往可影响到NS1蛋白的疏水性,局部亲、疏水性的变化尤其是C末端高度疏水区的氨基酸变异会影响NS1单体间的相互作用,使二聚体不能形成。文献报道247位Pro→Leu的突变会导致NS1蛋白不能二聚体化,从而使毒力降低。HANLEY等在研究中发现,NS5蛋白成对的氨基酸突变,即由带电荷的氨基酸突变为不带电荷的丙氨酸,将导致病毒产生温度突变株、宿主范围的突变株以及产生减毒血清型,这些NS5基因的改变可能成为减毒活疫苗的候选基因,用于制备有效的重组减毒活疫苗。2.35病毒的rna的合成及相关研究进展由于DEN病毒的大量复制与其所致人类的病毒血症呈现正相关性,从某种意义上说,能改变病毒复制有效性的NTRs基因的突变研究更应得到重视。在DEN病毒的非编码区,核糖体通过与(+)链RNA的5′末端结合启动翻译,而复制酶则与(-)链RNA的3′末端结合以启动(+)RNA的转录,调节复制过程。5′及3′NTR某些核苷酸变异往往会改变RNA-蛋白的相互作用,从而影响病毒的毒力。3′NTR序列根据其保守程度可被分为三个区域:(1)紧跟在开放读码框后的可变区域;(2)包括一个环化序列(CS1)和稳定茎环结构的高度保守的3′末端;(3)在可变区域与3′末端之间的中度保守序列,当中包括几个发夹结构。3′NTR具有三个高度保守区域CS1,CS2及RCS2。CS1被认为与一个位于病毒基因组C区5′端的补充序列相互作用,而碱基配对对于蚊传的黄病毒的RNA的合成是非常重要的。3′NTR的茎环结构使病毒RNA基因组趋于稳定,并增强了翻译启动。而其他一些研究已证明了茎环结构是RNA复制所必需,但不是病毒翻译所必需。将分离到的多位DF及DHF患者血清中的病毒株3′NTR进行比较,表明3′末端100nt的保守区序列一般无改变,在此保守区上游的核苷酸差异对毒力影响较大,对病毒的复制有效性起着重要作用。如美国0131株与东南亚k0010株的3′NTR除了在终止密码子后缺失了8nt(10276-10283)外,还存在5个散在的核苷酸差异,10297nt[G→A],10331nt[A→G],10388nt[A→T],10390nt[A→G]及10527nt[A→G],均位于3′末端的保守区序列上游,它们使3′NTR二级结构产生了很大的构象差异。对黄热病毒及TBE病毒3′NTR结构与毒力的相关性研究也有类似报道。在DEN疫苗研究中发现,将DEN-4的3′NTR的143-172nt共30个核苷酸嵌合至同源DEN1野毒株相同的核苷酸位点,构建新的嵌合病毒,用其免疫Huh-7-SCID小鼠后发现新的嵌合病毒对小鼠的毒力较弱,并且对于DEN1野毒株的感染有明显的保护作用。而且,DEN1和DEN4的3′NTR30个nt突变的新嵌合体病毒免疫机体后能产生针对4个型别DEN感染的四价疫苗。另一方面,对3′NTR可变区域的研究发现这个区域存在高的序列可变性及核苷酸缺失,这一现象可以在一些日本脑炎病毒株(JEV)(13-6nt)、虱传脑炎病毒(TBEV)(59-207nt)及黄热病毒(40-80nt)观察到。TAJIMA等最近识别了2株新的DEN-1型病毒株,分别在可变区域有