刺血疗法治疗急性痛风性关节炎大鼠模型的临床研究

刺血疗法治疗急性痛风性关节炎大鼠模型的临床研究

生理性疼痛是由酪氨酸代谢紊乱和排尿减少引起的一组疾病引起的。急性痛风性关节炎是痛风患者的最常见的首发症状。由于寒冷、饮酒过量、饮食无度等原因致使血清尿酸值发生波动,从而引起的痛风急性发作,临床以受累关节红肿热痛,不能忍受,关节活动受限为特征［１］。根据2012年的美国风湿病协会治疗和预防痛风的指南［２］,急性痛风性关节炎的治疗是以秋水仙碱及非甾体抗炎药的应用为主。目前西药治疗本病虽然有一定的疗效,但副作用及不良反应较多,使患者难以坚持［３］。临床已有相当数量的刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的文献报道。包括藏医在内的其他民族医学中的刺血疗法报道也提示刺血疗法治疗本病有操作简单、疗效佳、起效快、副作用少的优势［４－６］。有关刺血疗法治疗本病的效应机制和作用机制尚缺乏深入探讨,难以为临床推广提供可靠的科学依据。为此,科学设计和深入研究实属必要。我们拟对比观察刺血疗法对于急性痛风性关节炎大鼠模型的局部症状、光镜下形态学改变、电镜下超微结构改变的影响,初步探索刺血疗法治疗本病的效应机制。1材料和方法1.1实验动物与试剂1.1.1实验动物SPF级SD大鼠(200±20)g,雄性40只,由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号:SCXK2010-0001),单笼饲养于南京中医药大学实验动物中心,室温22~25℃,12/12h昼夜节律,自由进食与饮水,适应性饲养1周。1.1.2主要试剂尿酸钠(美国sigma公司生产,批号:BCBF1330V)。布洛芬混悬液(江苏恒瑞医药股份有限公司生产,国药准字:H19980017),布洛芬含量为20mg/mL。1.1.3主要实验仪器透射电镜(日本产JEM-1010)1.2术后处理和随访1.2.1尿酸钠溶液制备称取0.2g尿酸钠,充分研磨,加入4mL无菌生理盐水,制成5%尿酸钠混悬液,超声(KQ_500B)振荡混匀。1.2.2大鼠分组使用随机数字表将40只大鼠随机分成4组,分别为正常组10只,模型组10只,布洛芬组10只,刺血组10只。1.2.3模型制备方法使用10%水合氯醛,以0.35mL/100g的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉。正常组不处理,其他3组大鼠均将右后肢踝关节摆放成直角,充分暴露出踝关节与胫腓骨之间的间隙,以45°角从该间隙直插入右后肢背侧正中踝关节与胫腓骨之间的关节腔。造模的3组均用4号针头进行关节腔注射,每次注射前均以75%的酒精消毒。1.2.4治疗干预正常组、模型组不做任何治疗性干预;药物组分别于造模后6、24h以布洛芬120mg/kg［７］灌胃;刺血组分别于造模后6、24h在右侧昆仑穴(后肢外踝与跟腱之间的凹陷中)［８］,用0.7mm注射器针头点刺放血(深度约为0.3cm),以自然停止出血为度(先测量关节周径再治疗)。1.2.5关节局部症状观察正常组、模型组、药物组、刺血组在造模前、造模后6、24、48h分别用2~3mm的纸条测量造模踝关节的周径,每个时间点重复测量3次,取平均值［９］。1.2.6光镜病理切片的制备与观察造模48h后处死大鼠,每组随机各取5只,剪取右后肢踝关节(近端和远端各保留0.5cm),去皮,以10%甲醛固定24h,后用10%硝酸脱钙3d,每天更换硝酸,完全脱钙后梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片(厚4μm),常规HE染色观察局部关节腔形态学改变。1.2.7电镜标本的制备与观察造模48h后每组随机各取2只,剪取右后肢踝关节腔附近的关节软骨,固定于5%的戊二醛中。在4℃冰箱中固定24h后,用PBS冲洗4次,把关节软骨放置于10%的锇酸中放置在4℃冰箱2h,用PBS再冲洗2次,用2%醋酸铀块染2h,梯度酒精脱水,浸染样本,包埋,聚合。透射电镜下观察制作好的样本。1.2.8统计学处理采用SPSS16.0统计软件处理数据,实验数据以ue003±s表示。组内比较采用独立样本t检验;组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠患下肢关节周径、周径变化情况比较由表1可知,正常组4个时间点关节周径比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、药物组、刺血组造模6h与其造模前周径比较,差异均有统计学意义(P<0.05),说明造模成功。模型组造模后24h与造模后6h比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明大鼠的造模关节周径在6h至24h持续肿胀,局部症状加重;造模后48h关节周径分别与造模后6、24h比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明造模后大鼠患肢关节局部症状稳定,自愈现象不明显。药物组造模后24h与造模后6h比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明布洛芬给药早期(24h内)消除关节肿胀的效果不明显;造模后48h与造模后6h比较,差异有统计学意义(P<0.05),表明布洛芬给药24h后能改善关节局部症状,消除关节肿胀。刺血组造模后24、48h的关节周径分别与造模后6h比较,差异有统计学意义(P<0.05),表明刺血疗法能有效改善关节局部症状,消除关节肿胀,有起效快、疗效持续的优点。造模前各组右后肢踝关节周径比较,差异无统计学意义(P>0.05)。造模后6h各组间比较,造模干预的3组与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后24h各组间比较,刺血组与模型组、药物组比较,周径明显减小,差异有统计学意义(P<0.05);与正常组比较,关节周径无显著性差异(P>0.05)。造模后48h刺血组、药物组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。药物组、刺血组与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.2尿酸钠结晶沉积正常组的切片显示关节腔中未见渗出液,未见炎细胞浸润,关节表面光滑,无缺损;模型组的切片显示关节腔内有尿酸钠结晶沉积(粉色团块状物体),并有大量炎细胞浸润;药物组的切片显示关节腔内有部分尿酸钠结晶沉积(粉色团块状物体),并有部分炎细胞浸润;刺血组的切片显示关节腔内有少量粉色团块状物体沉积,及少量炎细胞浸润。见图1。2.3小鼠骨髓组织结构正常4组关节软骨样本在透射电镜下观察,除正常组,其他3组均有不同程度的破坏。正常组细胞正常,线粒体清楚,胶原纤维排列纵横交错,不具明显横纹或聚集成团状;模型组关节软骨样本显示其细胞膜少许破坏,细胞有渗出,突起,内质网扩张,胶原纤维排列乱且密集;药物组关节软骨样本显示其细胞有渗出,突起,内质网扩张,线粒体渐少,胶原纤维排列紊乱;刺血组关节软骨样本显示其细胞有少量渗出,基本细胞结构正常,胶原纤维排列较乱。见图2~3。3布洛芬给药及刺血疗法的联合应用疗效中医学认为血中瘀热是急性痛风性关节炎的发病关键。本病临床发病以受累关节红肿热痛、活动受限为特点。刺血疗法善治热证、实证、痛症、急症,具有清热、止痛、消肿、祛瘀的直接治疗作用,治疗本病则更具优势,且符合“菀陈则除之”、“血实宜决之”、“热则疾之”的针灸治疗原则。从上述实验结果可以看出,使用尿酸钠关节腔注射能较好的复制急性痛风性关节炎模型,关节肿胀明显,症状能持续48h且无自愈现象。布洛芬作为非甾体类抗炎药,给药后能一定程度减轻炎症反应,消除肿胀,缩小关节周径,但起效时间较晚(给药18h后起效)。使用点刺放血后,大鼠模型关节周径缩小明显,说明刺血疗法对本病有较好的抗炎消肿作用,起效迅速(刺血后即起效)。各组光镜下观察右后肢踝关节形态学改变可知,急性痛风性关节炎会有尿酸钠晶体沉积关节腔,并伴有大量炎细胞浸润。布洛芬给药及刺血疗法,均能使关节腔内尿酸钠晶体及炎细胞减少。其中,刺血疗法对于尿酸钠晶体沉积及炎细胞浸润的治疗效果更好。各组透射电镜下观察关节软骨超微结构可知,急性痛风性关节炎对于关节软骨细胞及胶原纤维的损害较大。布洛芬给药及刺血疗法均能改善尿酸钠对关节软骨超微结构的损害,且刺血疗法的改善作用更明显。尿酸盐结晶对关节腔