cd20与钙离子内流

cd20与钙离子内流

c20是人类b细胞表面的独特特征，但d20在b细胞表面的生理影响尚不清楚。CD20在B淋巴细胞表面以寡聚体形式存在,现有实验证明CD20在B细胞表面形成的是四聚体。CD20与B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)的膜型IgM(sIgM)存在相互作用已经被证实,B细胞活化后,BCR-CD20复合物会解离,磷蛋白、钙调素结合蛋白会暂时被招募到CD20,从而参与胞内信号的传导。钙离子流动对细胞的生物学功能有重要影响,钙池调控钙离子进入(store-operatedcalciumentry,SOCE)通过钙离子释放激活的钙离子(calcium-release-activatedcalcium,CRAC)通道来提高细胞内的钙离子浓度,是淋巴细胞提高胞内钙离子浓度的主要方式。越来越多的证据表明CD20参与了SOCE,CD20对于胞内钙离子浓度有重要的调节作用。1sd20和bcr1.1不同分离的b细胞bcrCD20分子属疏水、4次跨膜蛋白,相对分子质量(Mr)为33×103~35×103。CD20抗原表达于90%以上的B淋巴瘤细胞和正常的B淋巴细胞,而不表达于造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他正常组织。BCR是一种由异源寡聚体形成的复合体。目前证实BCR至少由2部分组成,一部分为sIgM,另一部分为Igα和Igβ。BCR是B淋巴细胞发育、分化和活化的重要调节分子,有2个基本功能:一方面作为免疫效应细胞直接参与免疫应答,介导体液免疫;另一方面作为特异性的抗原提呈细胞选择性地捕获抗原并提呈给T细胞,协同和调节T细胞免疫应答。1.2cd20t的表达Bubien等通过化学交联细胞表面的蛋白分子,经CD20免疫共沉,得到Mr分别为70×103和140×103的复合物,因为CD20单体的Mr为33×103~35×103,所以复合物可能是CD20的同源寡聚体。Deans等用标记的CD20和截短的CD20,通过免疫共沉淀证明CD20形成的是同源四聚体。为了检测每一个寡聚物中CD20单体的数目,Deans等把一个C端缺少20个氨基酸残基的截短的CD20(CD20TR)和天然的CD20分子(CD20WT)的cDNA共同转染到HEK293细胞(5μgCD20WT的cDNA和15μgCD20TR的cDNA),使得CD20WT低表达,CD20TR高表达。通过免疫共沉淀(用抗-CD20C,抗CD20的C端的抗体)和免疫印迹(用抗-CD20N,抗CD20的N端的抗体)得到CD20WT与CD20TR条带相对密度比例是3∶1,符合CD20能形成四聚体的推测。Deans等还用一个HA标记的CD20(CD20-HA)和CD20WT的cDNA共同转染HEK293细胞,得到了相似的结果,2种分子的条带相对密度比例也是3∶1,进一步证明了CD20同源四聚体的推测。值得注意的是,这种四聚体结构在细胞表面的离子通道中很常见,这样的结果使研究者们更加相信CD20就是一种钙离子通道,但随后的研究表明CD20自身并不形成离子通道。1.3cd20与bcr的相互作用通过用毛地黄皂苷(digitonin)溶解细胞,免疫共沉淀得到的CD20复合物Mr大于200×103,超过了CD20四聚体的大小(约140×103),表明CD20不仅能够形成同源四聚体,还存在其他的分子与CD20相互作用。为了验证细胞膜表面的其他何种分子与CD20相互作用,将BJAB细胞的膜蛋白用生物素标记,再裂解细胞,进行CD20的免疫共沉淀,用抗生物素蛋白进行免疫印迹,得到Mr分别约为80×103、68×103、45×103、35×103和29×103的5条带。35×103条带被证明是CD20分子;68×103的条带不是在每一次试验中都出现,而且有时在对照泳道也出现;45×103的条带不确定(质谱分析没有结果);80×103和29×103条带被证明分别是sIgM的重链(sIgμ)和轻链(sIgL)。换用Ramos细胞进行同样实验也得到了相同的结果。这些实验结果表明CD20与BCR的sIgM存在相互作用。B细胞活化后,BCR-CD20复合物会解离,磷蛋白、钙调素结合蛋白会暂时被招募到CD20,从而参与胞内信号的传导。而且,CD20与sIgM结合不依赖胆固醇,但是其中有脂筏(lipidrafts)的参与。胆固醇存在于真核细胞的细胞膜上,其含量一般不超过膜脂的1/3。胆固醇在调节膜的流动性、增加膜的稳定性,以及降低水溶性物质的通透性等方面都起着重要的作用。脂筏是细胞膜上富含鞘磷脂和胆固醇的细胞膜微区。脂筏在B细胞活化的过程中起重要作用,可以作为BCR传递信号的一个平台,也可能在抗原的传递过程中起作用。抗CD20的抗体结合到CD20以后引起了多种生物学效应,其中的一些生物学效应是依赖于脂筏的。一些种类的蛋白被集中在脂筏中,如糖基磷脂酰肌醇连接蛋白(GPI-linkedprotein)、二乙酰化和十六烷酰化蛋白(如Lyn),还有G蛋白偶联受体α亚基等,然而大多数的膜蛋白并不存在于脂筏中,如CD22和CD45。CD20组成性存在于脂膜中。BCR在B淋巴细胞静息期被排除在脂筏之外,只有少量的BCR存在于脂筏中,此时BCR与脂筏的亲和力很弱;但当BCR与抗原结合引起BCR自身寡聚化后,增加了BCR对于脂筏的亲和力,BCR随后就转移到脂筏中。BCR由脂筏外转移到脂筏上需要细胞膜上有胆固醇存在,这说明这种转移很有可能依赖于脂筏的完整性,因此胆固醇是脂筏的一种重要组成成分。鉴于CD20和BCR都大量存在于脂筏中,那么CD20和sIgM的结合很有可能是在脂筏中完成的,因此Deans等试图检验CD20和sIgM的结合是否依赖于脂筏中的主要成分之一———胆固醇。他们用甲基-β-环糊精(一种去除胆固醇的试剂)处理用生物素标记的Ramos细胞,用抗CD20单抗进行免疫共沉淀,用抗生物素蛋白进行免疫印迹。去除胆固醇的细胞和未去除的细胞得到了相同的结果。这说明CD20与sIgM的的结合是不依赖于胆固醇的,同样也不依赖于脂筏的完整性。2细胞内钙离子跨膜电导用CD20的cDNA转染不表达CD20的人类T细胞和小鼠前B类淋巴母细胞系,使2种细胞稳定表达CD20分子,通过全细胞膜片钳(whole-cellpatchclamp)和荧光显微镜检查细胞膜的离子电导和细胞内钙离子活性,发现2种转染后的细胞的钙离子跨膜电导都有很大的提高;用CD20的cDNA转染非淋巴细胞(人K562红白血病细胞和小鼠NIH-3T3成纤维细胞)也得到了钙离子跨膜电导的提高;用CD20单抗处理CD20+淋巴样干细胞也增加了钙离子跨膜电导。这种钙离子跨膜电导增加的现象与用CD20的cDNA转染细胞表现的电导特性是一样的,这些都说明CD20参与了B淋巴细胞的钙离子的流动,CD20在B淋巴细胞功能表达中扮演重要角色。2.1cd20自身对钙离子流动的诱导CD20的结构与一些离子通道很相似:每一个CD20单体都是4次跨膜,分子的N端和C端都在细胞质一侧,能形成多聚体。这些事实表明CD20可能直接调控B细胞跨膜钙离子电导,而且CD20的多聚体可能在B淋巴细胞膜上形成钙离子通道。Janas等即认为钙离子的流动源于CD20在细胞膜上形成的钙离子通道。然而,Unruh等却认为钙离子流动源自细胞内钙库的钙离子释放。为了验证这2种说法的正确性,Cragg等下调Ramos细胞BCR的表达,或使Ramos细胞不表达BCR,当用抗CD20的抗体作用这些Ramos细胞时不能诱导钙离子流。很明显,如果CD20自身能形成钙离子通道,用抗CD20的抗体作用Ramos细胞是应该有钙离子的流动的,然而当Ramos细胞不表达BCR时,抗CD20的抗体作用Ramos细胞没能诱导钙流,这说明抗CD20抗体引起的钙离子流动并不是依靠CD20自身形成的离子通道来完成的。也就是说Unruh等的观点是正确的,钙离子流动源自细胞内钙库的钙离子释放,它源于CD20与BCR的相互作用,而不是CD20四聚体自身形成钙离子通道。2.2su-统一的抗cd20抗体的诱导表达适当的抗CD20单抗都有能力提供有效的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)效应,而且这些抗体在产生ADCC效应方面没有任何差别。但基于这些抗体把CD20分配进入去污剂不溶的膜区域的能力、诱导同型细胞黏附以及诱导CDC效应的不同,这些抗体能分为2个类型,即Ⅰ型(如rituximab、2F2)和Ⅱ型(如B1、11B8)。分别用Ⅰ型和Ⅱ型抗CD20抗体诱导SU-DHL-4细胞系(一种滤泡淋巴瘤细胞),结果Ⅰ型能够诱导钙流,而Ⅱ型不能。然而当用其他的细胞系,如Unruh等用2种类型的抗体诱导Ramos淋巴瘤细胞钙流时,Ⅰ型和Ⅱ型的抗CD20抗体都没有诱导Ramos细胞产生钙流;但当加入高交联剂(hypercrosslinker,抗Fc片段的试剂)后,Ⅰ型抗CD20抗体产生了钙流,而Ⅱ型没有产生。对于是否需要高交联剂来辅助Ⅰ型抗CD20抗体产生钙流,Cragg等认为取决于CD20在B淋巴细胞上的表达水平。SU-DHL-4细胞表达的CD20数量是其他正常B淋巴细胞或B淋巴瘤细胞的3~5倍,表明SU-DHL-4细胞高表达CD20可能使其在被诱导钙离子流动时不需要加入高交联剂。为此用CD20特异的小干扰RNA(siRNA)来降低SU-DHL-4细胞CD20的表达,这时只加入Ⅰ型抗CD20抗体就不产生钙流,而当进一步加入高交联剂时钙流出现。其他的B淋巴瘤细胞(如Raji、BL60、Ramos)和正常的B淋巴细胞在用Ⅰ型抗CD20抗体诱导产生钙流时都需要高交联剂的存在,SU-DHL-4细胞可能只是一个特例,绝大多数B淋巴细胞在诱导钙流时都需要高交联剂。2.3内质网储藏的钙离子释放与soce相互作用SOCE是淋巴细胞提高胞内钙离子浓度的主要方式。SOCE对于B淋巴细胞和T淋巴细胞的活化以及细胞因子的表达都起到重要的作用。越来越多的证据表明CD20参与了SOCE。例如前文提到的不表达CD20的人类T细胞和小鼠前B类淋巴母细胞系,当使它们异位表达CD20时,这些细胞内的钙流水平显著提高。当BCR与抗原结合后,通过一系列的磷酸化反应,使磷脂酶C-γ2活化,进而使质膜上的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解为1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG),IP3促使内质网内的钙离子释放到细胞质。内质网内储藏的钙离子的耗尽,触发了第二期的胞外的钙离子流入,这个过程是依靠SOCE来完成的。SOCE过程需要2种关键元件:间质相互作用分子1(stromainteractionmolecule,STIM1)和ORAI1(也称作CRACM1)。根据目前的SOCE模型,由信号分子IP3诱导内质网上的IP3受体(IP3R)通道打开,导致了内质网储藏的钙离子释放,钙离子浓度降低。当内质网储藏的钙离子被耗尽后,STIM1分子被活化、移动到CRAC通道附近,通过与CRAC通道相互作用,改变CRAC构象,进而打开细胞膜上的CRAC通道,提高胞内的钙离子浓度。CRAC通道由一个或多个ORAI1家族蛋白构成。ORAI1是一种4次跨膜蛋白,N端和C端在胞内,其91位精氨酸残基突变为色氨酸残基可以导致CRAC功能的缺失,表现为患重度联合免疫缺陷病(SCID)。STIM1为单次跨膜分子,定位于内质网膜,其N端包含一个和钙离子结合的EF手基序(EF-handmotif),有带负电荷的残基(D76、D78和E87),这3个位点对于其感受钙离子浓度是至关重要的。SOCE通过CRAC通道引起的细胞外的钙离子内流,使得钙离子信号得到维持,而不至于因为内质网储藏的钙离子耗尽而消失。而且当刺激内质网内钙离子释放的因素减退,这些胞外流入的钙离子还可以储存进内质网。总之,SOCE对钙离子信号具有重要的调节作用,SOCE所引起钙离子流的强度和持续时间,由钙敏感蛋白转化成为不同的基因的表达,从而决定了受体与抗原结合后细胞的命运。3cd20的生物学功能很长一段时间以来,CD20仅仅作为B淋巴细胞表面特有的标志物,生产抗CD20的单克隆抗体用于淋巴瘤的治疗。虽然抗CD20的单克隆抗体在治疗淋巴瘤方面取得了很大的成就,但是对于CD20的生物学功能研究进展缓慢,与其在生物医药领域取得的巨大成就形成鲜明的对比。近些