芹菜素对苯肾上腺素大鼠血管的舒张作用

芹菜素对苯肾上腺素大鼠血管的舒张作用

通过植物提取的植物化学物质已成为当前研究的一个新方向。芹菜素属植物黄酮类物质,具有降压、抗炎等多种功效。体外血管环试验表明,芹菜素能够抑制电压操纵性和受体操纵性钙通道而抑制钙内流。离体血管环实验是研究血管生理学和药理学的重要手段。本研究利用大鼠离体胸主动脉环灌流技术,结合利用各种阻断剂,研究芹菜素舒张血管作用与内皮、钾通道、钙通道的关系,以期发现芹菜素舒张血管作用的可能机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1g新兴产品清洁级雄性Wistar大鼠,体重300~350g(中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心),许可证号:SCXK-(军)2007-004。1.1.2药物、试剂和仪器芹菜素(apigenin)、L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)、亚甲蓝(methyleneblue,MB)、吲哚美辛(indomethacin,INDO)、四乙氨(tetrathylamonium,TEA)、氯化钙(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-aminopyrimide,4-AP)、格列苯脲(glibenclamide)、5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoate,5-HD)、乙酰胆碱(Ach)、苯肾上腺素(phenylephrine,PE)均购自Sigma公司。格列苯脲、吲哚美辛和芹菜素均用DMSO溶解,TEA和4-AP用生理盐水溶解、其他试剂用蒸馏水溶解。预实验证明,DMSO的体积分数小于0.2%对血管的收缩没有影响。1.1.3pac、张力换能器、数控超级恒温槽BIO-PAC生物信号采集处理系统(美国BIO-PAC公司生产,MP150),张力换能器、数控超级恒温槽(西班牙PanLab公司生产,LE01086Automaticorganbath)。1.2方法1.2.1kreb内移植成血管大鼠胸主动脉环的制备参考文献并略加改进。腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠,迅速游离大鼠胸主动脉,置于4℃含95%O2和5%CO2混合气体预饱和的Kreb液中,剔除周围结缔组织,剪成3~4mm的血管环。据实验需要,采用棉签磨擦血管环内表面的方法,将部分血管环制备成去除内皮的模型。1.2.2企业和八通道前置装置不同时长系统调零后,将血管环固定悬挂于一对L型不锈钢丝弯夹上并置于浴槽内。悬挂血管环上方的不锈钢丝与张力换能器相连。张力换能器连接主机以及八通道前置附带装置。悬挂张力的变化通过计算机显示并由BIO-PAC计算机软件(ACKNOWLEDGE4.0)记录保存。浴槽的温度通过管道由超级恒温器控制在37℃恒温。保持浴槽中的Kreb液在20ml,并持续小剂量通入含95%O2和5%CO2的混合气体。血管环悬挂在张力换能器上后,调节前负荷为2.0g,平衡60min,期间每15min换液一次,并保持浴槽中液体的量稳定在20ml。1.2.3血管内皮完整性测定用KCl60mmol/L重复刺激3次,以诱发血管的最大收缩幅度。待血管环重新稳定后,用1μmol/LPE收缩血管环达峰值,加入10μmol/LAch检验血管内皮完整性。若加Ach后使PE预收缩的血管环舒张60%以上,可认为内皮完整;反之,则认为内皮去除。已完全去内皮的血管,用Ach后不产生舒张。1.2.4试验设计1.2.4.1.芹菜素对血管环的直接影响取去内皮和内皮完整的血管环,以累积加药法依次加入芹菜素(1、3、10、30μmol/L),观察血管环张力的改变。1.2.4.驳岸中紫菜素的量效试验取去内皮和内皮完整的血管环,分别以1μmol/LPE预收缩血管环,在达到坪值后,以累积加药法依次加入芹菜素(1、3、10、30μmol/L),给药间隔约10min,记录芹菜素作用的量效曲线,并计算最大效应(maximumeffect,Emax)以及芹菜素引起血管环达到Emax的50%效应时的浓度(EC50)。1.2.4.菜素量效曲线测定取内皮完整血管,在浴槽中加入L-NAME(100μmol/L)、MB(10μmol/L)、INDO(10μmol/L)于37℃孵育20min,加入1μmol/LPE,在收缩达到坪值后,以累积加药法依次加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),记录芹菜素作用的量效曲线。1.2.4.菜素量效试验取无内皮血管,在浴槽中加入TEA(5mmol/L)、BaCl2(100μmol/L)、4-AP(100μmol/L)、格列苯脲(10μmol/L),5-HD(100μmol/L)于37℃孵育20min,加入1μmol/LPE,在收缩达到坪值后,以累积加药法依次加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),记录芹菜素作用的量效曲线。1.2.4.从无钾环境下驳岸对pe收缩的影响(1)与电压依赖性钙通道的关系:观察芹菜素对去内皮血管由高钾(60mmol/L)引起血管张力的变化。(2)与受体操作性钙通道的关系:去内皮血管,用无钾液冲洗4~5次,加1μmol/LPE,达到收缩平台后,采用累计加药法加入芹菜素(1、3、10和30μmol/L),观察无钾环境下芹菜素对PE收缩的影响。(3)与细胞外钙内流的关系:去内皮的血管,用无钙液冲洗4~5次,加入PE至收缩稳定后,按浓度递增的方式加入CaCl2,比较有或无芹菜素(30μmol/L)(加PE前与血管环预孵育20min)存在时,血管张力随钙浓度的变化情况。1.3血管张力检测所有数据用表示,统计学分析采用SPSS15.0分析软件。以PE1μmol/L诱发最大收缩幅度为100%,以加入药物后的血管张力幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。所有数据均通过正态性检验,采用独立样本t检验进行分析,以P<0.05为差异有显著性。舒张百分比的计算公式为:2结果2.1蔡氏辛酯对血管环张力的影响分别取去内皮和内皮完整的血管环,以累积加药法加入芹菜素,在本试验剂量内,血管环的张力并无明显改变,提示芹菜素不影响血管环的静息张力。2.2血管张力的变化由图1可见,芹菜素在有或无内皮的血管上均可剂量依赖性地减小PE预收缩血管张力,但是在内皮完整的血管上,这一作用显著大于去内皮血管(P<0.01)。内皮完整组的Emax=76%,EC50=4.55μmol/L,而去内皮组的Emax=44%,EC50=48.4μmol/L。2.3内皮完整的血管从图2可以看出,预先给予INDO并不能抑制芹菜素引发的血管舒张作用。从图3可以看出,用L-NAME孵育内皮完整的血管环后,可明显抑制芹菜素引发的血管舒张,与未经L-NAME处理的内皮完整组相比,存在显著差异(P<0.01)。从图4可以看出,在有内皮的血管环模型上,MB可以显著降低芹菜素对PE预收缩血管的舒张作用。2.4tp、bacl2抑制剂的作用机制从表1可以看出,电压敏感型K+通道(Kv)抑制剂4-AP、线粒体ATP敏感K+通道(KATP)抑制剂5-HD、Ca2+激活的K+通道(KCa)抑制剂TEA、内向整流型钾通道(KIR)抑制剂BaCl2均能显著抑制芹菜素对PE预收缩去内皮血管的舒张作用(P<0.05)。而非特异KATP抑制剂格列苯脲对芹菜素舒张血管的作用则没有影响(P>0.05)。2.5菜素在血管管作用中的应用从表2可以看出,在无钾环境下芹菜素对PE引起的血管环收缩有显著抑制作用,推测芹菜素的舒血管作用可能涉及对细胞内钙释放或对受体操纵性钙通道的阻断作用。芹菜素对高钾引起的血管收缩具有显著的抑制作用,推测芹菜素的舒血管作用涉及到电压依赖性钙通道。从表3可以看出,无钙环境下,当PE预收缩达平台,再逐渐加入钙,芹菜素可显著降低加入Ca2+引起的血管张力的升高。3自由基因子nos抑制剂血管环模型试验研究结果显示,芹菜素可以浓度依赖性地抑制内皮完整及去内皮血管模型由PE引起的血管收缩,且在内皮完整血管上,芹菜素的舒血管作用显著大于去内皮血管,提示芹菜素引起的血管舒张效应涉及到内皮依赖性和非内皮依赖性两个途径。在内皮完整血管,血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)可以催化左旋硝基精氨酸生成NO,NO进入血管平滑肌细胞,作用于可溶性鸟苷酸环化酶(solubleguanylatecyclase,sGC),引起cGMP的升高,导致血管舒张。后者主要通过cGMP依赖性蛋白激酶作用使钙内流减少,增加钙ATP酶对钙的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管舒张。另一方面,NO可通过直接激活TEA敏感型钾通道而发挥舒血管作用。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME,sGC抑制剂MB可以显著削弱芹菜素的作用,推测芹菜素内皮依赖性血管舒张作用可能通过NO介途径导,这与以往的研究结果相一致。本研究提示芹菜素对去内皮血管环模型也具有显著的舒张作用,提示芹菜素还可能直接作用于血管平滑肌细胞引起血管舒张。血管平滑肌细胞钾通道的开放,造成细胞膜超极化从而使血管舒张,这在血管舒张中占有重要作用。激活血管平滑肌上的K+通道,往往引起细胞膜超极化,从而抑制细胞外钙内流,引起血管舒张。血管平滑肌上主要存在4种K+通道:ATP敏感K+通道(KATP),Ca2+激活的K+通道(KCa),电压敏感型K+通道(Kv)和内向整流型K+通道(KIR),格列苯脲为KATP非特异性抑制剂,5-HD为线粒体敏感KATP抑制剂(mito-KATP),TEA、4-AP、BaCl2分别为KCa、Kv、KIR的抑制剂。本研究显示,4种抑制剂(TEA、4-AP、BaCl2、5-HD)均可显著减弱去内皮血管环模型芹菜素的血管舒张作用,提示芹菜素的血管舒张作用可能还与其激活K+通道有关。然而,CALDERONE等认为KCa可能并未参与芹菜素的血管舒张,确切的原因有待进一步研究。血管平滑肌细胞内Ca2+含量的变化是血管进行收缩和舒张的关键性因素。血管平滑肌细胞膜上存在电压依赖性钙通道(VDC)及受体操纵性钙通道(ROC),他们分别被高钾和PE激活。高钾主要是引起平滑肌细胞去极化,激活细胞膜上的VDC,引起细胞外钙离子内流,产生收缩,同时细胞外钙离子的内流也诱导了细胞内雷诺丁(ryanodine)敏感钙池的钙释放,即所谓的钙诱导的钙释放(CICR),升高细胞内钙,增强血管平滑肌收缩。本实验发现芹菜素对高钾引起的血管收缩具有明显抑制作用,提示芹菜素可能通过减少KCl诱导的VDC内流而发挥其舒张血管的作用。PE则可通