白地霉fl44菌株发酵条件的优化

白地霉fl44菌株发酵条件的优化

豆腐生产应消耗大量的水和排放大量的废水（主要是黄浆水）。黄浆水中有机物质很丰富,直接排放使水质COD、BOD值明显增加,对环境造成严重污染,还浪费了大量有用的物质,非常可惜。酸浆是传统工艺豆腐制作过程中所用的一种蛋白凝固剂,是黄浆水经多种微生物混合发酵的产物,具有特殊的酵香,同时还含有特殊的一些生物活性物质。从酸浆中分离筛选出一株高产蛋白的白地霉FL44,是适合利用豆腐黄浆水生产单细胞蛋白的优良菌株。如能利用黄浆水通过生物合成蛋白质,有化害为利,变废为宝的重大意义。为此我们以豆腐生产废液(黄浆水)为原料,进行了优良菌株的选育及工艺条件的探索。1材料和方法1.1材料表面主要原料:黄浆水(购于市场普通豆腐坊);废糖蜜(购于山东高密糖厂);菌种:白地霉FL44菌株,从酸浆中分离筛选出,实验室保存。1.2摇瓶种子培养基斜面活化培养基:葡萄糖2%,用黄浆水配制。摇瓶种子培养基:葡萄糖2%,用黄浆水配制。摇瓶发酵培养基:根据有关文献和现有条件,在黄浆水中添加一定的营养物质。1.3设备和设备HZQ-Q振荡器,TDL-5低速台式大容量离心机,台面式818型pH测试议,722分光光度计,电热恒温干燥箱。1.4方法1.4.1角瓶培养模式将菌种移接到斜面活化培养基上,30℃下活化24h后接1环于摇瓶种子培养基中,在30℃下振荡培养约20h,然后按5%接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中,在30℃下振荡培养48h(摇床转速为180rpm)。1.4.2湿菌体的制备发酵液转入离心管中,以3500rpm离心15min,自来水水洗两次,去上清液得湿菌体;将湿菌体于50℃烘干24h,达恒重,电子天平称重。1.4.3测定蛋白质含量的方法1.4.4测量血糖和ph值的目的2结果与讨论2.1废糖蜜对蛋白和生物量的影响由于黄浆水培养基中营养物质不能满足菌体的大量生长,所以选择添加一些比较经济的营养物质,以利于菌体的生长。选择黄浆水培养基外加碳源时,考虑添加0%~8%废糖蜜,结果见表1。从表1可知添加废糖蜜对白地霉FL44生物量和蛋白产量都有明显的影响。随着废糖蜜添加量的增加,生物量和蛋白产量逐渐增加;但当废糖蜜添加量大于6%时,生物量和蛋白产量的增加很小,综合产量并结合成本等因素,初步选择在黄浆水培养基添加6%废糖蜜。2.2磷酸盐对黄浆水培养基中fl49生物量和蛋白产量的影响在黄浆水培养基中添加硫酸铵、磷酸氢二铵、碳酸铵和尿素4种不同浓度的不同氮源,实验结果见表2。由表2可知添加氮源可以明显提高生物量和蛋白产量,而磷酸氢二铵对白地霉FL44生物量和蛋白产量提高最大,且在添加1%磷酸氢二铵时生物量和蛋白产量均已达到最高,因此选择在黄浆水培养基中添加1%的磷酸氢二铵。磷酸盐浓度对单细胞蛋白生产的影响极为显著,磷酸盐不足时,糖代谢受抑制,生长缓慢。添加磷源可以明显提高产量。2.3发酵温度对白地霉fl49生物量和蛋白产量的影响发酵温度和培养基初始pH值对发酵结果的影响分别见表3和表4。从表3可见,发酵最适温度以30℃为宜,此时白地霉FL44生物量和蛋白产量均最高。表4显示,适宜的培养基初始pH值为5~6,可以作进一步实验确定。2.4物量和蛋白产量的影响选择接种量5%、10%和15%,考查白地霉FL44发酵时间、生物量和蛋白产量的影响,结果见图1和图2。从图1和图2中可以看出,5%~15%接种量对白地霉FL44的生长时间、生物量和蛋白产量没有很大影响,因此可以考虑经济因素,以小于5%接种量作进一步实验。2.5摇瓶转速对菌体产蛋白的影响因为白地霉是好氧发酵的菌株,所以发酵液中溶解氧对白地霉生物量和蛋白产量都有较大的影响。通过改变250mL三角瓶装液量和摇瓶转速来考察溶解氧对菌体产蛋白的影响。选择250mL三角瓶装液量为30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL和摇瓶转速为0rpm、140rpm、180rpm、220rpm、260rpm,进行实验,结果见图3和图4。从图3可见,40mL/250mL三角瓶为最佳摇瓶装液量,图4显示,可以选择最佳摇瓶转速为220rpm。2.6正交实验结果根据以上单因素试验,选择对白地霉FL44产蛋白影响较大的不同水平的废糖蜜、磷酸氢二铵、pH值、接种量,设计正交实验L9(34),通过正交实验,确定白地霉FL44生物量和蛋白产量的最优条件。实验选取的因素及水平见表5,实验结果见表6。通过正交试验的优化组合,得到白地霉FL44最优培养条件是:5%废糖蜜、1%磷酸氢二铵、初始pH值5.5、4%接种量,与单因素试验比较,降低了废糖蜜的用量,但达到了同样的蛋白产量。2.7白地霉fl49生物量及菌体蛋白含量测定采用正交实验优化组合的培养基进行摇瓶发酵,定时取样测定生物量、蛋白产量、含糖量、pH值等,以了解碳源、菌体生长及生理代谢的变化情况。实验结果见图5。从图5中可以看出,白地霉FL44生物量在培养8h左右进入对数生长期,30h左右进入稳定期,48h生物量达到最高,之后生物量开始缓慢下降。菌体蛋白含量则在32h~40h达到最高水平,之后,蛋白含量开始下降,到64h后,菌体蛋白含量稳定。生物量的多少直接影响到蛋白的总收率(=菌体生物量×菌体蛋白含量),综合生物量和蛋白含量考虑,蛋白产量在48h达到最高,之后,开始下降,至60h稳定,因此,确定最适培养时间为48h。3蛋白和总糖含量测定通过实验研究初步确定白地霉FL44利用黄浆水产蛋白的摇瓶培养基组成和培养条件为:5%废糖蜜、1%磷酸氢二铵、初始pH值5.5、4%接种量,装瓶量40mL/250mL三角烧瓶、摇瓶转速220rpm、30