一种实时测定反应产物对映体过量的新方法

一种实时测定反应产物对映体过量的新方法

1柱前衍生法nmr法在合成或分离过程中，实时检测映射单元的错误e.e。这对于优化进程条件和确定反应结论非常重要。目前,e.e.实时检测方法主要有手性色谱法(手性固定相、手性流动相添加剂,柱前衍生法)与核磁共振(NMR)法。手性色谱法虽被证实是检测e.e.最为可靠的方法,且较方便,但手性固定相或流动相添加剂价格昂贵,且对被分析对映体结构有较高要求。一些结构简单的对映体(低级醇、酯等),在目前的手性色谱中尚未得到令人满意的分离。尽管通过柱前衍生法可使其在手性色谱上得到拆分,然而衍生试剂的筛选、繁琐的过程以及定量分析的准确性等限制了其在实时检测e.e.过程中的应用。NMR法除了仪器本身造价昂贵外,还需要引入外源手性试剂,增加了实时检测过程的工作量。随着检测技术的发展,旋光检测器(PD)已经能够满足高效液相色谱(HPLC)灵敏度以及体积要求,使其作为HPLC的新型检测器,在手性技术中发挥了重要作用。HPLC-UV-PD已开始越来越多地用于对映体定性检测,且已被用于少数对映体e.e.定量实时检测。但该法将UV与PD两种检出限、灵敏度与线性范围均有较大差异的检测器串联使用,不仅对进样量要求严格,还会使柱外效应增加;UV的引入要求被分析物须有较强紫外吸收,否则灵敏度不高;更重要的是,该法必须用待测手性物的单一对映体纯品配制一系列确定e.e.的样品,经HPLC-UV-PD检测后绘制标准曲线,再用内插法得出待测样品的e.e.,使得检测过程繁琐。尤其是在新手性物研发过程中,单一对映体纯品不可能得到,因此该法很难成为一种通用检测法。根据一定检测条件下,单一对映体旋光度与其浓度成正比的基本性质,根据反应方程式定量关系并利用HPLC-PD,本研究建立了一种非手性色谱实时检测对映体e.e.的新方法,并与常规检测方法做了对比,证实了该方法简便、可靠以及适用范围广,有望成为实时检测e.e.的通用方法。2不同浓度中c、n、p含量的合成法测定旋光峰面积的求取以外消旋体(R,S)-C的化学或酶促拆分为例,其反应通式可表示为:利用非手性色谱与常规HPLC检测器(UV、FLD等)联用,通过流动相与流速的优化,可在色谱工作站上分别得到体系中物质C、B、CB3种物质的响应信号,但却无法辨别其中的(R)-C和(S)-C,这也是非手性色谱本质所决定的。但如果将非手性HPLC与PD联用,依据反应方程式定量关系,经过计算,可以准确得知反应通式(1)中C以及CB的e.e.。根据旋光度计算公式α=[α]tλλt×c×l可知:当测试环境(光源、温度,光程)不变时,在一定浓度范围内,[α]tλλt为常数,单一对映体旋光度α仅为一个与其浓度c成正比的物理量,则同时存在(R)-CB与(S)-CB的样品(若(S)-CB较(R)-CB占优),其旋光度α与(cS-cR)成正比,经HPLC-PD检测,得到工作站上的一个信号点,所有信号点连接在一起,即为旋光峰。设N为反应起始时(R,S)-C的加入量(mol),X为t时刻C的总转化率;XR为t时刻(R)-C的转化率。根据反应方程式可得:t时刻CB总量为N×X,(R)-CB的量为0.5N×XR,则(S)-CB的量为N×X-0.5N×XR,此时反应体系体积为V0。若A为t时刻从反应体系抽取样品中CB的旋光峰面积;AS为标样(S)-CB的旋光峰面积(样品与标样注射量相同,都为V1)。则:其中,MCB为CB分子量,ρCB为CB密度。MCB与ρCB为CB物性参数;N通过反应初始加料量计算出;X为C的总转化率,可以通过液相色谱、气相色谱或其他方法检测;V0为取样时反应体系总体积,可以直接测量,对于某些反应体系,可将其近似看成理想溶液,因而反应体系总体积V0为体系中各组分体积之和;旋光峰面积A与AS由HPLC-PD检测得出。数据代入方程(2)后即可解出XR。因此,反应过程中任意时刻C与CB的e.e.即可通过下式算出:由此可知,只要过程中检测条件保持一致,该法就能迅速获得反应体系任意时刻样品中各对映体e.e.,且对被分析物结构没有任何要求,适用范围较广。3检测方法的验证以猪胰脂肪酶(PPL)催化酯交换动力学反应拆分(R,S)-2-甲基-1-丁醇为例,通过2个对比实验证实检测方法的准确性与可靠性。反应原理为:(R,S)-2-甲基-1-丁醇+乙酸乙烯酯−→猪胰脂肪酶(S)−→猪胰脂肪酶(S)-乙酸异戊酯+(R)-2-甲基-1-丁醇+乙醛3.1高效液相色谱法(S)-2-甲基-1-丁醇(99%,Fluka公司);(R,S)-2-甲基-1-丁醇(99%,Acros公司);猪胰脂肪酶(Fluka公司);冰乙酸、去离子水、乙酸乙烯酯、甲醇(AR)均购于成都科龙公司,使用前经干燥与精馏处理。高效液相色谱(美国Waters公司),包括SymmetryShieldTMRP18色谱柱(5μm,3.9mm×150mm)、Waters515型高压输液泵;AllChromPlus工作站(美国MultiLink公司);Jasco2090Plus旋光检测器(日本Jasco公司);流动相:甲醇∶去离子水=2∶1(V/V),流速:0.6mL/min;色谱柱以及旋光检测器温度均为30℃。SQ-206气相色谱仪(北京分析仪器厂),包括PEG-20M柱、氢火焰离子检测器;载气:N2,流速:25mL/min;H2、空气流速分别为36mL/min与360mL/min;汽化室、柱箱与检测器温度分别为:190℃、95℃、190℃。WZZ-2B自动旋光仪(上海精密科学仪器有限公司)。3.2s-乙酸异戊酯分离纯化一定量(S)-2-甲基-1-丁醇与冰乙酸在浓硫酸催化下反应生成(S)-乙酸异戊酯,经分离纯化后,用气相色谱检测纯度(须>98%,方可投入后续实验使用)。3.3不同度对酯、醇、适合的降解(S)-2-甲基-1-丁醇与乙酸乙烯酯混合液(摩尔比=1∶1.3)中,加入一定量猪胰脂肪酶(酶:醇=1∶10,质量比),在磁力搅拌器(260r/min)中反应,温度分别控制在20℃、30℃、35℃、45℃、55℃。每隔2h抽样,用气相色谱检测样品中酯与醇的峰面积比K,并根据转化率标准曲线内插得醇转化率X,用HPLC-PD检测产物(S)-乙酸异戊酯的旋光峰面积A,并根据式(4)计算其e.e.。(R,S)-2-甲基-1-丁醇酶促脂交换反应同上,与乙酸乙烯酯混合液在磁力搅拌器中反应,利用HPLC-PD检测产物e.e.,当其达到最大值时,停止反应。精馏分离出(S)-乙酸异戊酯并用NaOH溶液水解,得终产品(S)-2-甲基-1-丁醇,用自动旋光仪测试其旋光度。4结果与讨论4.1线性结果与标样的转化率由检测原理可知:反应中C(醇)转化率X的准确性对于检测方法可靠性至关重要。本实验以气相色谱检测转化率(也可用液相色谱)。以标样的转化率X对气相色谱检测的峰面积比K(酯/醇)作图(见图1)。标准曲线表达式为:X=0.1951K6-0.9799K5+2.162K4-2.7737K3+1.9413K2-0.0151K,(0≤X≤0.6),R2=0.9997,则反应过程中任意时刻样品中醇转化率X即可由气相色谱分析结果计算出。4.2峰面积as检测算法精密度和稳定性是衡量检测方法的重要指标。(S)-乙酸异戊酯用HPLC-PD检测其旋光峰面积AS,分别于同一天与连续6d内进行检测(检测条件保持一致),计算日内相对标准差和日间相对标准差(进样量为5μL)。日内RSD为0.44%(n=5),日间RSD=0.27%(n=6),该结果说明HPLC-PD精密度高,由仪器带来的偶然误差很小。4.3转化率x0.6对b-5个时段的e.e.在(S)-2-甲基-1-丁醇的酯交换反应过程中,(S)-醇乙酰化生成了(S)-乙酸异戊酯。理论上,反应体系任意时刻抽取样品中(S)-2-甲基-1-丁醇与(S)-乙酸异戊酯都有e.e.=100%。在5个不同温度下,对抽取样品进行测定,(S)-2-甲基-1-丁醇的转化率X以及(S)-乙酸异戊酯的e.e.,如表1所示。由表1中5个温度段和5个时间段总共50组e.e.数据可以看出,当转化率X≤0.6时,样品中CB(乙酸异戊酯)97.3%≤e.e.≤103.8%,最大相对误差REmax=3.8%,平均相对误差REav=2.224%。由以上数据中可以看出,84%的e.e.(21组)都在97%与103%的范围内,其相对误差RE<3%。另外16%相对误差较大的e.e.(4组)都是在X的最小值与最大值出现的。在检测原理方程中,X与A都是与真实值存在一定误差的测量值,而转化率X是用气相色谱(FID检测器)检测,FID检测器的灵敏度与线形范围远远高于HPLC-PD,因而X的相对误差要更小一些。由此推断:当X较小时(X<0.3),生成的(S)-乙酸异戊酯的量较小(体积百分含量X﹤16%),此时由HPLC-PD得出的A与真实值出现了偏差;而当X较大(0.6～0.7)时,此时A相对误差较小,而X却位于转化率标准曲线的末端。用数学表达式计算出的X相对误差增大,从而使e.e.相对误差增加。由于HPLC采用手动进样,不能保证每次V1完全一致,也会引入一定误差,因此,在峰形良好的情况下,采用大进样量(5μL),可以减小误差。4.4s-2-甲基-1-丁醇及hplc-pd的比较(R,S)-2-甲基-1-丁醇与乙酸乙烯酯在PPL催化下发生酯交换反应,当产物e.e.值达到最大时,停止反应。通过精馏分离出(S)-乙酸异戊酯,将其碱水解,得到的(S)-2-甲基-1-丁醇经干燥、蒸馏后,测试旋光度(以99%(S)-2-甲基-1-丁醇作标样,αD=-4.515,t=30℃),并与HPLC-PD所得结果相比较,见表2所示。由此可知,用自动旋光仪检测出旋光度并与标准品对照的常规检测方法的结果,与采用HPLC-PD检测新方法的e.e.结果比较,其最大相对误差REmax=2.85%,说明了该方法是准确并且可靠的。4.5试验方法的应用和普4.5.1-pd实时定性分析在新手性物研发过程中,即使没有单一对映体标样(即AS未知,仅能作为一个常量),仍可通过HPLC-PD实时定性分析求取反应过程抽取样品中对映体e.e.。由式(4)可知,当AS未知,仅作为一个常量,反应过程中任意时刻t2所抽取样品中产品CB的e.e.相对大小仍能依据式(5)求出:固定t1(t2>t1),随着反应进行,Δe.e.会出现一个极大值,可以确立反应终点以及优化反应条件。4.5.2实时定量检测样品中对映射体e.e在新手性物研发过程中,可根据4.5.1所述,确定反