超微粉碎对茯苓多糖溶出度的影响

超微粉碎对茯苓多糖溶出度的影响

椰子是多孔菌科的干燥菌核。它的味道又甜又平，属于心脏、肺、脾和肾。具有除湿利尿、健脾健胃、安神等功效。主要含有椰子糖（约93%）、三乙二醇乙酸钠和椰子酸。此外，它还含有木胶、甲壳素、蛋白质、脂肪、物质、粘液、棕榈、组氨酸、水杨酸和硫酸。茯苓多糖为茯苓的主要药理活性成分,茯苓多糖通过增强免疫功能,激活免疫监视系统,抑制肿瘤细胞DNA、RNA合成等机制,发挥抗肿瘤作用,茯苓多糖还具有抗衰老、抗氧化等作用。有研究表明,水提只能提取少量的茯苓多糖,以粉末入药为佳。超微粉碎技术是指借助于特殊的机械力、射流能力或物理、化学作用,使普通物质超微化。它是20世纪80年代迅速发展起来的一项跨学科、跨行业的高新技术,已被广泛应用于化工、医药、食品、农药、化妆品、染料、涂料、电子、航空航天等许多领域。用超微粉碎技术对中药材进行处理后,细胞破壁率大于95%,有效成分溶出速度加快,溶出量增加。本实验对茯苓超微粉与茯苓细粉中茯苓多糖的溶出度进行比较研究,为茯苓超微粉用于临床,提高茯苓的临床疗效提供实验依据,为进一步研究打下基础。1仪器和试剂盒1.1碎机、中草药粉碎机激光粒度测定仪(Winner3001型激光粒度测定仪,济南微纳仪器有限公司);粉碎机(BFMT6BI型翻滚式贝利粉碎机);中草药粉碎机(FW135中草药粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司);溶出仪(ZRS-8G智能溶出试验仪,天津大学无线电厂),紫外分光光度计(UV-9200紫外可见分光光度计,北京瑞利分析仪器公司)。1.2样品茯苓(湖南海川医药有限公司提供),葡萄糖对照品(中国药物生物制品检定所),苯酚,浓硫酸均为分析纯。1.35%苯试剂的制备取苯酚加热蒸馏收集182℃的馏分,吸取此馏分10ml加水至200ml置棕色瓶内,放冰箱备用。1.4对照溶液的制备精密称取干燥恒重的葡萄糖标准品14.5mg加蒸馏水溶解并定容至250ml容量瓶中,即得。2目和200目的超微粉取市购茯苓药材1000g,40～50℃干燥,分为4份。两份用普通粉碎机分别粉碎成100目和200目的常规细粉,另两份用贝利粉碎机分别粉碎成300目和400目的超微粉。以硫酸-苯酚法、紫外分光光度法进行测定,通过预试确定最佳反应条件为:加入5%苯酚试剂1.2ml,浓硫酸4.5ml,室温下反应并放置20min,在490nm处测定吸光度A。2.3精密度与加样回收率2.3.1标准曲线的绘制精密吸取葡萄糖对照品溶液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml分别置于20ml试管中,分别加蒸馏水至1.0ml,加入5%苯酚溶液1.2ml,混匀后加入浓硫酸4.5ml,充分混合,室温放置20min,在490nm处测定吸光度A。求得标准曲线的回归方程:Y=9.3207X-0.005(X:对照品含量;Y:吸光度),相关系数r=0.9996(n=7),表明在0.058～0.58mg范围内葡萄糖含量与吸光度之间有良好的线性关系。2.3.2精密度实验精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0ml5份,分别置于20ml试管中,同“2.2”项操作,测定吸光度A,RSD=0.96%(n=5),表明仪器精密度良好。2.3.3重复性实验精密吸取供试品溶液1.0ml6份,分别置于20ml试管中,同“2.2”项操作,测定吸光度A,RSD=1.02%(n=6),表明重复性良好。2.3.4加样回收率实验精密称取已知含量的样品,准确加入对照品一定量,依法测定,计算回收率。结果见表1。分别精密称取适量的不同粒径的茯苓药粉,分别置于900ml溶出介质中,(37±0.5)℃水浴,转速为60r·min-1,6h后,取样2ml,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液在上述色谱条件下测定不同粒径的茯苓药粉的茯苓多糖的含量,作为不同粒径茯苓药粉的100%溶出时茯苓多糖的溶出量。为了使样品在溶剂中具有良好溶出曲线,通过预试确定:转速60r·min-1,水浴温度(37±0.5)℃,溶出介质900ml人工胃液,分别于2,4,6,8,10,15,20,25,30,45,60min取样2ml,用0.45μm微孔滤膜滤过,同时补充同温度同体积的溶出介质,取续滤液1.0ml,置于20ml试管中,同“2.2”项操作,分别测定其吸光度A,根据回归方程求出茯苓多糖含量,计算累积溶出百分率。根据威布尔分布用Casiofx.180p拟合直线,提取溶出度参数T50(药物溶出50%所需时间)、Td(药物溶出63.2%所需时间)、m(溶出曲线斜率)。结果见表2～3。对T50,Td,m进行方差分析,用t检验进行多组均数间两两比较。结果表明不同粒径的茯苓药粉的茯苓多糖的溶出参数间的差异具有统计学意义(P<0.05)。300目茯苓药粉组与400目茯苓药粉组的溶出度参数T50比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表4。3茯苓粉粒径对茯苓多糖溶出度的影响多糖在强酸作用下水解生成单糖,并迅速脱水生成糠醛,糠醛与酚性物质如苯酚缩合成有色化合物,反应迅速,完全,有色物质稳定,并且有色物生成量与多糖浓度存在定量关系,因此用分光光度法在适当波长处可以得到多糖含量。同时,配制好的5%苯酚溶液应冷藏避光保存,以免苯-硫酸作空白时颜色加深,影响准确度。由表2可以看出,随着茯苓粉体粒径的减小,茯苓多糖的体外溶出速率加快;不同粒径的茯苓药粉的茯苓多糖的溶出度相比有显著性差异,其中超微粉(300目和400目)明显优于常规细粉(100目和200目),这是因为随着茯苓颗粒的超微化,粒径变小,比表面积增大,有效成分与溶出介质间的有效接触面积增大,溶出介质进入颗粒中心的距离缩短,从而使得有效成份的溶出速率加快。同时,超微化后的药材具有强的表面吸附力、亲和力、分散性和溶解性,从而提高了有效成分的溶出速率。另一方面,粒径越小的粉末比表面积越大,表面能升高,使粉末处于非稳定状态,易聚集、流动性和分散性差。所以实验结果中300目的茯苓药粉比400目的溶出度大。药用有效成分主要存在于细胞内,有效成分需经过浸润、溶胀、渗透和扩散等过程方能溶出。药材经过超微粉碎后,其有效成分直接暴露出来,使有效成分溶出速度加快,溶出量增多。超微粉使