一种抗赤潮毒素的贝毒提取液的制备及检测方法的建立

一种抗赤潮毒素的贝毒提取液的制备及检测方法的建立

近年来，中国沿海潮涨频繁。赤潮不仅破坏海洋渔业资源和生产,恶化海洋环境,更严重的是,有些赤潮种类能产生毒素,在海产品体内长期富集,当人们食用赤潮毒素污染的海产品后就可能出现中毒现象甚至死亡。根据对人类的中度症状和机制差异可将赤潮毒素分为以下5种:麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹泻性贝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、记忆缺失性贝毒(amnesiashellfishpoisoning,ASP)、神经性贝毒(neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)和西加鱼毒(ciguaterafishpoisoning,CFP)。其中,PSP和DSP是我国海洋赤潮生物中最常见的2种。海产品继病原菌、弧菌和病毒之后,赤潮毒素又成为威胁海产品质量的另一问题。因此,对海产品的麻痹性贝毒进行检测对于保证广大消费者健康安全有重要意义。1材料和方法1.1水产品市场市场样品采自上海市几个重要的海产品批发市场,主要有沪西水产品、铜川水产品、曹安四平水产品、福山路水产品市场。采集的种类主要为贻贝、海湾扇贝、扁玉螺等常见的海产品,有些也是赤潮毒素敏感种类。1.2实验动物的制备PSP的小鼠生物检测方法按照AOAC标准方法进行。打开贝壳,取一定量的软组织置于匀浆器中匀浆,称100g匀浆加入100ml0.1mol/LHCl,搅匀后调pH值为2～4。水浴煮沸5min;冷却至室温后再调pH为2～4,然后离心(3000r/min)5min,上清液即为贝毒提取液。取8只小鼠,称重后,在每只腹腔内注射1ml贝毒提取液,记录小鼠的死亡时间。实验小鼠购自中国科学院上海实验动物中心,测试品系为KM系雌性小鼠。所测麻痹性贝毒的毒力用100g贝类软组织含有的鼠单位(MU)表示,1个鼠单位的定义是15min内杀死1只20g重小鼠的腹腔注射剂量。1.3毒种毒素化合物检测选择几份小鼠法已检测有毒的样品进一步用HPLC检测。PSP的检测采用高碘酸柱前衍生化方法进行。上述贝毒提取液经0.45μm滤膜过滤后,即可用高碘酸进行氧化。0.3mol/LNa2HPO4、0.3mol/L甲酸铵和0.03mol/L高碘酸等体积比混合,配制高碘酸混合液。在1.5ml的Micro-Tube中加100μl的样品或毒素标准物(pH=7)及500μl新配制的高碘酸混合液,在室温下反应1min,加入5μl冰醋酸以终止反应。均匀混合后静置10min,注射50μl反应产物进入HPLC系统中。HPLC条件:Waters600四元梯度泵,WaterssymitryRP-18柱(4.6mm×150mm),Waters474荧光检测器。流动相为二元流动相,A相为0.1mol/L的甲酸铵溶液,B相体积分数为5%的乙腈溶液,流量为1ml/min。荧光检测器的激发波长为330nm,发射波长为390nm。毒素标样为GTX1/4、NEO、GTX2/3和STX。这几种毒素化合物的检测限为:GTX1/4,69pg;NEO,37pg;GTX2/3,40pg;STX:37pg。所用液体试剂均为色谱纯。2样品的毒力检测小鼠法共检测出8份样含有PSP,这些样品分别是5月份的海湾扇贝(2份),六月份的海湾扇贝(2份)和扁玉螺(1份),7月份的海湾扇贝(1份),10月份的海湾扇贝(1份)和扁玉螺(1份)。毒力范围是159.81～615.66MU/100g。8和9月份样品没有检测出PSP。有毒的样品大部分采自沪西和铜川水产市场(表1)。HPLC法对5份有毒的样品检测表明,6和7月份的海湾扇贝样品10月份扁玉螺样品含有PSP毒素,其含量分别为1.94、0.48和0.19μg/100g,主要成分是GTX2/3而另外2份样品未检测出PSP毒素(表2)。3赤潮毒素风险PSP是一种神经性毒素,能造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。对人体的中毒量为600～5000MU,致死量为3000～30000MU。WHO规定,100贝类可食部分的PSP毒力超过400MU(相当于80μgSTX)时不得食用。我国的PSP的警戒标准和WHO的标准一致。根据这一标准,5月份在沪西和铜川水产市场采集的海湾扇贝样品PSP含量都超出警戒值,应禁止食用。其他几份有毒样品的PSP含量虽没有超出警戒值,但应少量食用或避免食用。从种类上看,有毒的海产品主要为海湾扇贝、扁玉螺等,这些种类贝类为赤潮毒素敏感种类,食用时应当谨慎。关于PSP,国内也有不少报道。林燕堂等用小白鼠法对广东沿海的PSP做了一些研究,发现华贵栉孔扇贝、栉江珧和翡翠贻贝含毒素量较高,而牡蛎、蚶和青蛤等贝类含毒素量较低。YU等利用优化的HPLC方法对中国贝类和的PSP的检测分析表明,连云港有一些贝类样品,含有PSP毒素;江天久等用HPLC法对广东大亚湾的华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝所含的PSP进行分析,发现2种贝类消化腺的毒素成分相同,主要为GTX5和C1/2。除上述至毒生物种类外,还有菲律宾蛤仔、红带织文螺和织文螺等。因此,为确保上海市海产品的食用安全,应对上述生物种类进行重点检测。小白鼠生物检测法和高效液相色谱法是检测赤潮毒素的2种常用方法。小白鼠法相对简单,能对所抽提的全部毒素的毒性测定,使用最为广泛,是目前被所有实验室认可的标准检测方法。但小白鼠法不能测定毒素的含量和组分,而且容易出现假阳性现象。而HPLC法正好弥补了这些缺点。现HPLC检测结果也表明,引起小白鼠死亡的物质并非都是PSP的主要成分,也可能为其他类型的有毒化合物。同时,HPLC法也有一定的缺点,那就是毒素标准物质难以全部