水华束丝藻粗提物对小鼠血液生物力学的影响

水华束丝藻粗提物对小鼠血液生物力学的影响

近年来，赤潮发生在世界附近的靠海海域。赤潮生物产生的海上毒素通过海上食物网络而导致各种贝类、鱼类、鸟类和沿海居民的家人、家人和家人，造成巨大的海洋经济损失。而各种海洋生物的食用价值日愈为人们所认可,逐渐进入普通家庭,越来越多的人也进入这一毒素食物网,人们误食有毒贝类而死亡的报道已屡见不鲜。在这些海洋毒素中,麻痹性贝毒可说是最常见、危害也最大的一种。麻痹性贝毒是石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)及其衍生物共20多种毒性、毒量均不同的毒素的统称,它们的毒理是相同的,只是毒性有差异。在这些毒素中,STX和新石房蛤毒素(neo-STX)较为稳定,且毒力较高;而膝沟藻毒素(GTX)等在一定的温度和酸度条件下较易发生转化,且毒性比前两者弱,故不利于毒素的研究。蓝藻水华束丝藻(Aphanizomenonflos-aquae)是一种较易培养的淡水藻,其所分泌的麻痹性贝毒主要是STX毒素和neo-STX毒素,且含量很高,适于作麻痹性贝毒研究的毒素材料来源。目前,国内外学者在STX对动物心血管和血压的作用等方面做过不少的研究报道。为了保持毒性,麻痹性贝毒一般都在酸性条件下提取和保存,以及在酸性条件下进行毒力测定。所以,研究毒素和酸对动物的毒性作用关系有其必要性。本文就STX和酸性生理盐水对小白鼠血液若干生理指标的影响进行初步的探讨,以便为STX中毒的诊断和防治提供帮助,并为今后的进一步研究打下基础。1材料和方法1.1材料表面水华束丝藻由暨南大学水生生物研究所提供。健康无孕、18~22克左右的雌性昆明小白鼠购自暨南大学实验动物厂。1.2方法1.2.1培养瓶和培养程序培养基采用Mahmood所采用的BG-11培养基。5L血清瓶,以气泵通空气,每天摇瓶1次。培养温度24℃~25℃,培养瓶表面光强在培养初期为70~90μmol/(m2·s)后期为150~200μmol/(m2·s)。培养20天后离心收集藻细胞。1.2.2提取毒素细胞经离心收集后,加0.1mol乙酸,冻融4次,然后离心得上清液,作为毒素粗提液。1.2.3小鼠毒副反应总毒素含量ld50采用AOAC小鼠生物检测法。腹腔注射1ml适当稀释的粗提物,使小鼠死亡时间为5~7min,然后根据Sommer氏表,确定粗提物的毒性,以小鼠单位MU表示,1MU定义为15分钟使20g小白鼠中毒致死所需的毒素量。空白实验:取2只小白鼠,在其腹腔处注入1ml盐酸溶液(pH3.55),1小时内无死亡。毒性实验:根据以往预试验,取0.3mlSTX提取液,用HCl(pH3.55)稀释至6ml(pH4.72)。取5只小白鼠,于每只腹腔注射1mlSTX稀释液,观察记录每只小白鼠的死亡时间,死亡判定以最后一次喘息为准。1.2.4小鼠血清学指标检测取18~22g小白鼠64只,分成9个组。其中,4个组的小白鼠分别腹腔注射1mlpH5.3的生理盐水(对照组);4个组的小鼠分别腹腔注射1ml0.5MU/ml生理盐水STX毒素(pH5.3),作为染毒组;1个组做空白组(不注射)。在30min,6h,12h,24h后,分别对一组染毒小鼠和一组对照组小鼠进行摘眼球采血,空白组在同样条件下用相同方法进行采血。用AC970型全自动血球计数仪对所采血样进行分析。2结果2.1小鼠毒力大小及死亡症状所对应的sommer表t采取AOAC小鼠生物检测法,腹腔注射1ml适当稀释的藻毒素提取液,使小鼠死亡时间落在4~8min内,观察其死亡症状,根据sommer表换算毒力大小。查sommer表可知,小白鼠平均死亡时间为306秒所对应的鼠单位是约1.89MU;而平均体重为19.92克时对应的鼠单位校正系数约为1.000。所以,1mL该STX提取液的毒素含量为:鼠单位×稀释倍数=1.89Mu×(6ml/0.3ml)=37.8MU。2.2红细胞计数采用单因素F测定,所得数据见表2和表3。其中的缩写,RBC:红细胞计数,HGB:血红蛋白计数,HCT:红细胞压积,MCV:红细胞平均容积,MCH:红细胞平均血红蛋白,MCHC:红细胞平均血红蛋白浓度,PLT:血小板计数,WBC:白细胞计数,LYM:淋巴细胞,MID:中性分叶细胞,GRA:颗粒细胞。2.3差无明显差异时的单尾概率分别对0.5,6,12,和24h后的酸性对照组和染毒组的对应生理指标进行两组数据的单因素F测定,所得方差无明显差异时的单尾概率列于表2中。将在腹腔注射0.5MU/mlSTX(pH5.3)或0.9%NaCl(pH5.3)后没有显著影响的红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和有显著或极其显著变化的红细胞压积(HCT)、白细胞(WBC)、中性分叶细胞(MID)和颗粒细胞(GRA)按0.5、6、12、24h的顺序制成表3。3stx分次注射毒性试验从表2中,我们可看出:0.5h后,酸性生理盐水对照组小白鼠的白细胞数量与染毒组小白鼠的白细胞数量间有显著差异;其中,中性分叶细胞的数量则有极其显著差异,其余各指标均无显著差异。6小时后,所有指标无显著差异。12h后,酸性生理盐水对照组小白鼠的红细胞压积与染毒组小白鼠的红细胞压积之间有显著差异。24h后,两组小白鼠间的各指标中只有GRA有极其显著差异。从数据中,我们至少可以得出两点:第一,0.5MU/mlSTX在腹腔注射小白鼠后的0.5、6、12、24h这几个时间段除了对红细胞压积(HCT,见表3)有显著影响外,对小白鼠的红细胞,血红蛋白,血小板等没有显著影响,然而,却引起白细胞的数量发生显著或极其显著的变化;第二,在毒素注射后的不同时间,白细胞数量的变化程度和变化趋势是不一样的,且几种占优势地位的白细胞(如,LYM,MID,GRA等)占总白细胞数量的百分比在发生改变。这些变化从表3中可看出。从表3的RBC和HGB看来,虽然不同时间段的数据有较大差异(染毒组RBC:9.196×1012/L,7.925×1012/L,8.523×1012/L,8.038×1012/L,8.43×1012/L;染毒组HGB:148.2g/L,131.4g/L,139.7g/L,135g/L,139.3g/L),但酸性生理盐水对照组和染毒组之间却几乎一样。换句话来说,至少对于0.5MU/mlSTX,在本实验所测的几个时间段,导致这些数据不同时期的变化的原因是酸中毒(0.9%NaCl,pH5.3),而不是STX(0.5MU/ml,pH5.3)中毒。在表3的WBC、MID和GRA中,有两个共同的特别显著的地方:其一,在0.5h时间段,染毒组与酸性生理盐水对照组之间的差距特别明显,后者大多是前者的一倍以上(WBC数量,STX组:1.93×109/L,HCl组:4.23×109/L;MID数量,STX组:0.29×109/L,HCl组:1.02×109/L;GRA数量,STX组:0.11×109/L,HCl组:0.689×109/L),而其它时间段则不明显;其二,每一个染毒组的数据几乎都是在0.5h时间段降到最低点,其后慢慢回升,而酸性生理盐水对照组的数据都是在12h时间段才降到最低(WBC降到2.90×109/L;MID降到0.31×109/L;GRA降到0.06×109/L),然后再恢复到正常水平。对以上结果分析,pH5.3,0.5MU/ml的STX进入小白鼠血液后,酸和STX毒素分别通过神经体液等调节系统影响各血细胞生理指标,在0.5h内,主要是STX毒素发挥毒理效应,随着STX毒素分布到各组织器官及通过排泄系统排出体外,其毒性效应也逐渐减弱;而酸则在12h时发挥最大毒力效应,随后也逐渐减弱。从表3中,我们还可看到,在12h以前,每个时间段的中毒组数据都要比酸性生理盐水对照组数据小,而24h的数据则稍大。其原因可能是,12h之前STX毒素的毒力作用占主导,而24h则是酸中毒占主导。当然,这个结果是基于0.5MU/mlSTX毒性和pH5.3酸度的基础之上的,不同的STX毒量和酸度会使这种关系发生移动,这有待于进一步的研究。经过精确的定量研究,确定STX毒量和酸度与染毒深浅之间的数量关系,再辅于血气指标与染毒深浅之间的数量关系,或许可作为一种简易、快速的STX中毒临床试验方法。据目前所知,动物STX中毒死亡的