蛋白质结构新

第二章蛋白质结构1蛋白质概述2氨基酸3蛋白质结构与功能4蛋白质分析法1蛋白质概述1、开展历史2、生物学功能3、概念4、组成及N含量的测定2蛋白质概述-开展历史费歇尔〔EmilFischer〕确定了分子的氨基酸的根本骨架。1902年他提出了蛋白质的多肽结构学说。指出：蛋白质分子是许多氨基酸以肽键结合而成的长链高分子化合物。随后他合成了100多种多肽化合物，1907年，他制取了由18种氨基酸分子组成的多肽。由于积劳成疾，身体状况恶化，也由于第一次世界大战爆发，费歇尔不得不中断了这一重要的研究。3蛋白质概述-开展历史英国生物化学家弗雷德·桑格尔〔Fred(Frederick)Sanger，1918年8月13日—2021年11月19日〕。分别获得1958年和1980年诺贝尔化学奖。他是同一领域内两次获奖的第二人，测序。1958：弗雷德·桑格尔创造酶法测定人胰岛素序列，从而确定胰岛素的分子结构，开创了蛋白质测序的领域。1980：弗雷德·桑格尔、沃尔特·吉尔伯特共同荣获诺贝尔化学奖。他们的奉献在于：分别使用不同的方法测定DNA的序列。Sanger法后来成为主流，并用于人类基因组方案〔HGP〕的测序。41951年，鲍林发现了蛋白质的根本结构〔二级结构〕〔1954年和1962年获诺贝尔奖〕。蛋白质概述-开展历史莱纳斯·卡尔·鲍林〔LinusCarlPauling，1901年2月28日－1994年8月19日〕，美国著名化学家，量子化学和结构生物学的先驱者之一。1954年因在化学键方面的工作取得诺贝尔化学奖。1962年因反对核弹在地面测试的行动获得诺贝尔和平奖。他所撰写的?化学键的本质?被认为是化学史上最重要的著作之一。51960年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌红蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构，获1962年化学奖。

50年代后期，豪普特曼和卡尔勒建立了应用X射线分析的以直接法测定晶体结构的纯数学理论，在晶体研究中具有划时代的意义，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起了重要作用。他们因此获1985年化学奖。

蛋白质概述-开展历史6蛋白质的生物学功能1〕作为生物催化剂enzyme2〕代谢调节功能hormone3〕免疫保护功能Ab4〕物质的转运和储存功能binding-component5〕运动与支持6〕参与细胞间信息传递蛋白质概述-生物学功能7蛋白质概述-概念什么是蛋白质？蛋白质(protein)是由许多氨基酸〔aminoacid)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质的生物学重要性蛋白质是构成生物体的根本成分，占人体干重45%，细胞70%。8组成蛋白质的元素主要元素：碳〔50%—55%〕、氢〔6%—8%〕、氧〔19%—24%〕、氮〔13%—19%〕；次要元素：硫、磷、铁、锰、锌、碘。蛋白质元素组成的特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%那么可通过测N→测Pr。即每克样品蛋白质的含量=每克样品的含氮量×6.25测氮的方法：凯氏定氮法蛋白质概述-组成91、凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐；

碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收；

以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。蛋白质概述-N含量测定10蛋白质概述-N含量测定2、双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L-10g/L含量的蛋白质溶液测定。11蛋白质概述-N含量测定3、考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。12氨基酸1、氨基酸的通式2、氨基酸的分类3、氨基酸的特点4、氨基酸的理化性质13氨基酸〔aminoacid〕：含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的根本组成单位。氨基连在α-碳上的为α-氨基酸。天然氨基酸均为α-氨基酸。氨基酸1、氨基酸〔AA〕的通式α-氨基和α-羧基142、氨基酸的分类〔根据氨基酸分子的化学结构〕〔1〕脂肪族氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮、蛋、天冬、谷、赖、精、丝、苏、半胱、天冬酰胺、谷氨酰胺〔2〕芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸〔3〕杂环族氨基酸：组氨酸〔4〕杂环亚氨基酸：脯氨酸氨基酸152、氨基酸的分类〔根据侧链基团的结构和性质不同〕非极性氨基酸〔疏水氨基酸〕8种丙氨酸〔Ala〕缬氨酸〔Val〕亮氨酸〔Leu〕异亮氨酸〔Ile〕脯氨酸〔Pro〕苯丙氨酸〔Phe〕色氨酸〔Trp〕蛋氨酸〔Met〕

极性氨基酸〔亲水氨基酸〕：氨基酸的极性取决于侧链基团，如果侧链是不对称的极性基团，这个氨基酸就是极性氨基酸。极性氨基酸包括：带电荷的五种，再加上Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr。氨基酸161〕极性不带电荷：7种甘氨酸〔Gly〕丝氨酸〔Ser〕苏氨酸〔Thr〕半胱氨酸〔Cys〕酪氨酸〔Tyr〕天冬酰胺〔Asn〕谷氨酰胺〔Gln〕2〕极性带正电荷的氨基酸〔碱性氨基酸〕3种赖氨酸〔Lys〕精氨酸〔Arg〕组氨酸〔His〕3〕极性带负电荷的氨基酸〔酸性氨基酸〕2种〔or4?〕天冬氨酸〔Asp〕谷氨酸〔Glu〕氨基酸17氨基酸18氨基酸193、氨基酸的特点：〔1〕20种根本氨基酸中，除脯氨酸为亚氨基酸外，其余19种均符合通式；〔2〕除甘氨酸的R基为H外，其余19种α-碳原子为不对称碳原子，有L、D型之分，但组成人体蛋白质的氨基酸均为L型。按Fischer投影式：羧基在上方，氨基在左侧的是L型，在右侧的是D型。〔3〕不同氨基酸的侧链基团不同。氨基酸20氨基酸4氨基酸的理化性质无色晶体，熔点一般在200℃以上。不同的氨基酸其味不同，有的无味，有的味甜，有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。各种氨基酸在水中的溶解度差异很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。〔1〕熔点和溶解度21氨基酸〔2〕两性解离及等电点等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。22氨基酸+OH-+H++OH-+H+pH<pI阳离子pH=pI氨基酸的兼性离子

pH>pI阴离子23氨基酸小题：在生理pH下以下哪一种氨基酸带正电荷？A天冬氨酸B色氨酸C谷氨酸D半胱氨酸E赖氨酸24氨基酸〔3〕紫外吸收氨基酸的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种蛋白质氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区〔<220nm〕均有光吸收，在紫外区〔近紫外区〕〔220nm—300nm〕只有三种氨基酸有光吸收能力，这三种氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)。25氨基酸原理：它们的R基含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大光吸收在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白质一般都含有这三种AA残基，所以其最大光吸收在大约280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。分光光度法测定蛋白质含量的依据是朗伯—比尔定律，在280nm处蛋白质溶液吸光值与其浓度成正比。

26蛋白质结构与功能〔一〕肽(peptide)(二〕蛋白质的分子结构〔三〕结构与功能27蛋白质结构与功能〔一〕肽(peptide)*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的化学键。28+蛋白质结构与功能-HOH甘氨酰甘氨酸肽键29蛋白质结构与功能肽键由于共振而具有局部双键性质，因此，肽键比一般C-N键短，且不能自由旋转肽键原子及相邻的a碳原子组成肽平面相邻的a碳原子呈反式构型30蛋白质结构与功能肽键比一般C-N键短肽键为一平面相邻的a碳原子呈反式构型31蛋白质结构与功能*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合那么形成三肽……*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。概念32多肽链的两端蛋白质结构与功能N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端33蛋白质结构与功能(二）蛋白质的分子结构一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构34蛋白质结构与功能一级结构：定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。35蛋白质结构与功能一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的根底。36二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键：氢键多肽可以折叠成几种规那么结构。

蛋白质结构与功能37蛋白质结构与功能

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)无规卷曲(randomcoil)

38蛋白质结构与功能

-螺旋右手α-螺旋每圈有3.6个氨基酸，在肽链的N-H与相隔三个残基的C=O基团间形成氢键以稳定其整体结构。

α-螺旋的稳定性很好，除甘氨酸及脯氨酸外的其他各种氨基酸通过肽键构成主链时都有形成α-螺旋的倾向。

39蛋白质结构与功能Thebeta-sheet

-折叠常见的蛋白质二级结构之一，它呈片状，肽链几乎完全伸展的，而非紧密卷曲平行式。平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同。在蛋白分子内部更多出现的是平行的β-折叠片；而反平行的β-折叠片一段暴露于溶剂中，一段埋于蛋白内部，其氨基酸序列常为亲水和疏水的氨基酸交替排列。

40蛋白质结构与功能β－转角肽链走向的屡次逆转，主要是通过β-转角来实现的，可使肽链出现180°回折。β-转角大多分布在球状蛋白质分子外表，以改变肽链。它是一个发夹式转折，其特点是在于多肽链中第n个残基的-CO基与第n+3个残基的-NH基形成氢键。因此，一个多肽链的走向可以得到很好的扭转。β-转角在球状蛋白质中是重要的二级结构，起到连接其他二级结构的作用。41蛋白质结构与功能无规卷曲：没有确定规律性但拥有紧密有序的稳定结构的肽链构象，主链间可形成氢键，主链与侧链之间也可以形成氢键。这些氢键共同维持了它结构上的稳定。无规卷曲大体上分为两种，即紧密环和连接条带。a、紧密环〔compactloop〕：肽链片段的主体结构形成一段开放的环状，其主链卷曲成希腊字母Ω故又称Ω环。b、连接条带：α-α连接；α-β和β-α连接；42蛋白质结构与功能钙结合蛋白中结合钙离子的模体

锌指结构

在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)或基序。模体43蛋白质结构与功能氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为根底的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。相对应的结构预测软件44蛋白质结构与功能三级结构：不同的二级结构区域和连接区的组合折叠成一个确定的三级结构，结果是绝大多数亲水性氨基酸在外外表，而疏水性氨基酸在内部，其结构经非共价相互作用，有时是二硫键来稳定。变性往往导致二级和三级结构的丧失。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等45蛋白质结构与功能46结构域蛋白质结构与功能大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。47

结构域、基序、家族与进化：结构域可在一条肽链中形成半独立的结构和功能单位。结构域常由一个基因中的单个外显子编码。新的蛋白质可能是从外显子的新组合即由此产生的蛋白质的结构域的重新组合进化而来。

基序(motif)是二级结构元件组合或在蛋白质家族的相关成员中常发现的氨基酸序列。

蛋白质家族通过基因复制和随后的基因趋异进化产生。蛋白质结构与功能48蛋白质结构与功能四级结构有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。49分子伴侣蛋白质结构与功能分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水局部结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。50蛋白质结构与功能从一级结构到四级结构51蛋白质结构与功能〔三〕结构与功能蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的根底；而蛋白质独特的性质和功能那么是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。1、蛋白质一级结构与功能2、蛋白质高级构象与功能52一级结构与功能的关系蛋白质结构与功能例：镰刀形红细胞贫血正常N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu···C(146)非正常N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu···C(146)53蛋白质结构与功能蛋白质空间结构与功能的关系Hb〔血红蛋白〕与Mb〔肌红蛋白〕一样能可逆地与O2结合。Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数〔称百分饱和度〕随O2浓度变化而改变。54血红蛋白运氧中有别构作用：当血红蛋白分子第一个亚基与氧结合后，该亚基构象的轻微改变，可导致4个亚基间盐键的断裂，使亚基间的空间排布和四级结构发生轻微改变，血红蛋白分子从较紧密的T型转变成较松弛的R型构象，从而使血红蛋白其他亚基与氧的结合容易化，产生了正协同作用。蛋白质结构与功能55蛋白质结构与功能协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用那么称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用那么称为负协同效应(negativecooperativity)56蛋白质结构与功能变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：假设蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。57蛋白质的分析法蛋白质别离纯化蛋白质浓缩、枯燥和保存蛋白质分析和研究技术蛋白质测序和功能分析等58蛋白质别离纯化的意义1〕从生物材料中别离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，说明生命现象的本质有重大意义。2〕工业生产需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。3〕医疗需要：胰岛素治疗糖尿病。蛋白质的分析法-别离纯化59别离纯化的要求1〕纯度：取决于研究的目的和应用上的要求。研究一级结构、空间结构与功能的关系的蛋白质制剂；工具酶和标准蛋白等都要求均一；工业应用的酶和蛋白质制剂到达一定纯度即可。2〕活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3〕收率：希望收率越高越好，但在别离纯化过程中总会有损失，而且提纯步骤越多，损失越大。蛋白质的分析法-别离纯化60别离纯化的一般程序生物大分子的别离纯化一般可分为以下几个阶段：①材料的选择和预处理②破碎细胞及提取〔有时还需要进行细胞器的别离〕③别离纯化：包括粗分级别离和细分级别离

前两个阶段为生物大分子别离纯化的前处理。蛋白质的分析法-别离纯化61蛋白质的分析法-别离纯化1、别离纯化前处理2、蛋白质别离纯化条件〔溶液环境〕3、蛋白质混合物别离方法62蛋白质的分析法-别离纯化前处理细胞的破碎别离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。假设材料是体液或生物体分泌到体外的分泌物，那么不必进行组织细胞的破碎。631〕机械法通过机械切力作用使组织细胞破碎的方法，如匀浆、研磨、捣碎。高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约三分之一体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。此方法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少的动物脏器组织。蛋白质的分析法-别离纯化前处理细胞破碎方法：64蛋白质的分析法-别离纯化前处理玻璃匀浆器652〕物理法通过各种物理因素作用使组织细胞破碎，如超声法、反复冻融法、冷热交替法、低渗裂解法。超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。该方法多适用于微生物材料，例如用大肠杆菌制备各种酶。该方法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感的样品和核酸应慎用。反复冻融法：将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。蛋白质的分析法-别离纯化前处理66蛋白质的分析法-别离纯化前处理超声波细胞破碎仪673〕化学法有机溶剂法：〔丙酮〕；外表活性剂：SDS,Triton-100；酶解法：溶菌酶，蛋白酶等〔较温和〕。蛋白质的分析法-别离纯化前处理68细胞器的别离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。细胞器的别离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经屡次分步离心后，即可获得所需组分。蛋白质的分析法-别离纯化前处理69蛋白质的分析法-蛋白质别离纯化条件1〕缓冲液缓冲液对维持一定pH值下蛋白质的稳定及重复性十分重要。一般pH在7.0-7.5之间。2〕盐、金属离子和鳌合剂大多数蛋白在稀盐溶液中才能溶解，因此采用含盐的缓冲液，通常用0.1-0.2M的NaCl或KCl来模拟生理状态下的离子强度。为减少金属离子对蛋白质的影响，可以在缓冲液中参加特异的金属离子鳌合剂。蛋白质别离纯化条件〔溶液环境〕703〕复原剂细胞在破碎状态，一些蛋白会被氧化而失去活性，可参加复原剂如抗坏血酸巯基乙醇，二硫苏糖醇等。4〕去污剂作用是破细胞膜，释放细胞内蛋白(1)离子型去污剂SDS对蛋白质有变性作用(2)非离子型去污剂TritonX-100,NP-40变性作用较弱。5)蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性，减少对蛋白质的降解。常用的蛋白抑制剂有PMSF,Pepstatin,Leupeptin等。蛋白质的分析法-蛋白质别离纯化条件71蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法1、利用溶解度差异的别离方法〔1〕盐析法用于粗别离,原理是中性盐溶液破坏蛋白质亲水基团与水形成的水化膜程度和改变蛋白质带电情况。〔2〕有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提脂蛋白的提取液。〔3〕等电点法利用蛋白质在等电点的溶解度最低，而各种蛋白质具有不同的等电点的特点进行别离的方法。72蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法2、根据分子量不同的别离方法〔1〕透析和超滤透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。73蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法〔2〕平衡离心法根据蛋白质大小、形状不同进行别离的技术。〔3〕凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小别离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶〔Sephadexged〕和琼脂糖凝胶〔Agarosegel〕。74〔4〕聚丙烯酰胺凝胶电泳〔PAGE〕

(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE〕蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法凝胶电泳分类：75原理:SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。强复原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中参加复原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法76蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法2.装置

垂直板状 圆盘状 水平板77蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法78蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法染料种类:79考马斯亮蓝染色银染色蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法凝胶染色结果：80蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法3、根据电荷不同的别离方法离子交换层析(IonExchangechromatography,IEC)离子交换剂有阳离子交换剂〔如：羧甲基纤维素；CM-纤维素〕和阴离子交换剂。当被别离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度方法将吸附的蛋白质洗脱下来。81蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法4、特异性别离亲和层析〔affinitychromatography〕许多生物大分子具有与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特性，分子间的这种结合能力称为亲和力。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand〕的分子能特异而非共价地结合。亲和层析法是别离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中别离出来，而且纯度很高。82蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法亲和层析示意图83蛋白质的纯化无固定的模式，不同的蛋白质有不同的纯化方法，同一种蛋白质也可采取不同的纯化方法，但最终得到的蛋白质其稳定性和纯度也有所差异，这就涉及到操作者的实践经验及对纯化艺术的理解。蛋白质的分析法-蛋白质混合物别离方法小结：84蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、枯燥和保存1〕样品的浓缩生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。〔1〕减压加温蒸发浓缩〔2〕空气流动蒸发浓缩〔3〕冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中〔4〕吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。〔5〕超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下〔氮气压或真空泵压〕通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保存，这是近年来开展起来的新方法。85蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、枯燥和保存2〕枯燥生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要枯燥处理，最常用的方法是冷冻枯燥和真空枯燥。冷冻枯燥：将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的枯燥方法。真空枯燥：是一种将物料置于真空负压条件下，使水的沸点降低，在真空负压条件下可使水的沸点降到20℃甚至零度以下开始蒸发。86蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、枯燥和保存3〕贮存生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。枯燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将枯燥的样品置于枯燥器内〔内装有枯燥剂〕密封，保持0－4度冰箱即可。液态贮藏时应注意以下几点。〔1〕样品不能太稀，样品太稀易使生物大分子变性。〔2〕一般需参加防腐剂和稳定剂。〔3〕贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的那么要求更低，应视不同物质而定。87蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术1、Western-Blotting(Immunoblotting免疫印迹〕蛋白质印迹法(免疫印迹),根本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。可以对混合物中一种或多种特异蛋白进行定性和半定量检测。88蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术Western-blot过程示意图89蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术WesternBlotting的操作步骤〔1〕、SamplePreparation〔2〕、GelelectrophoresisStackinggel(5%)PH=6.8Separationgel(>5%)PH=8.890Electrophoretictransfer

nitrocelluloseorpolyvinylidenefluoride(PVDF)membrane蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术〔3〕蛋白质的电转移〔Nitrocellulosetransfer〕91Preventnon-specificproteininteractionsbet