基因工程与药物蛋白生产课件

基因工程与药物蛋白生产1.Sometherapeuticproductsforusedinhumans基因工程与药物蛋白生产ProductTypeTradenameFDAApp.CompanyUseInsulinR/SHumulin1982EliLilyDiabetestreatmentGrowthhormoneR/SProtropin1985GenentechGrowthhormonedeficiencyinchildrenα-interferonSDTIntronA1986Schering-PlouphHairycellleukaemiaHepatitisBvaccineVRecombivaxHB1986Merck&Co.HepatitisBpreventionTissueplasminogenactivatorSDTActivase1987GenentechMyocardialinfactionGrowthhormoneR/SHumatrope1987EliLilyGrowthhormonedeficiencyinchildrenHepatitisBvaccineVEngerix-B1989SmithKlineBeechamHepatitisBpreventionFactorVIIIR/SRecombiaterAHF(anti-haemophiliacfactor)1992BaxterHealthcareTreatmentofhaemophiliaFactorVIIIR/SKogenate1993BayerTreatmentofhaemophiliaDNaseSDTPulmozyme1993GenentechTreatmentofcysticfibrosissymptomsGenentech公司1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！基因工程与药物蛋白生产Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产interferon

1

1990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）基因工程与药物蛋白生产美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN

1brhuIFN

1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience基因工程与药物蛋白生产白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-CSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral基因工程与药物蛋白生产抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline基因工程与药物蛋白生产体内用单克隆抗体ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克隆抗体PanorexMurineMABGlaxoWelcome中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名缩写开发生产公司批准时间适应症rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业1989试1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖锐湿疣，疱疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新1997正1996正1997正1997试1997试HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuINF

上海生研所克隆丽珠生物工程1994试1995试1995试类风湿类风湿类风湿rhuIL2长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995试1995试1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗基因工程与药物蛋白生产rhuG-CSF[RecombinantHumanGranulocyte-ColonyStimulatingFactor(G-CSF)]九源1997试化疗生白血病rhuGM-CSF[RecombinantHumanGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactor-glycosylated(GM-CSF)]特宝1997试化疗生白血病rSK(Recombinant

streptokinase,rSK)医大实业1996试心梗溶栓rhuEPO(RecombinantHumanErythropoietin)

华欣永铭维沃1997试1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGF（外用）(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)珠海东大1996试创伤，烧伤基因工程与药物蛋白生产2.Insulin:Conversionofpreproinsulintoinsulin基因工程与药物蛋白生产Thestructureofinsulin基因工程与药物蛋白生产proinsulinandproductionofrecombinant-derivedinsulinbyseparatefermentationsforA-andB-chains基因工程与药物蛋白生产ProcessusedtomakehumaninsulinfromfusionproteinssynthesizedinE.coli基因工程与药物蛋白生产ExpressionofhumaninsulininE.coli基因工程与药物蛋白生产3.Growthhormone:Dwarfism

基因工程与药物蛋白生产Structureofthefirstvectorusedtoproducehumangrowthhormone(hGH)inE.coli基因工程与药物蛋白生产Bacterialproductionofhumangrowthhormone(hGH)基因工程与药物蛋白生产Bacterialproductionofhumangrowthhormone(hGH)基因工程与药物蛋白生产4.HBVvaccineProductionofasubunitvaccineinyeast基因工程与药物蛋白生产Productionofasubunitvaccineinyeast基因工程与药物蛋白生产5.tPAProductionoftissueplasminogenactivator(tPA)bymammaliancellculture基因工程与药物蛋白生产Fab-antigenbindingfragment

Fc-fragmentofconstantregion

Fv-fragmentofvariableregion

Fd-VH+CH1

ScFv-singlechainfragmentofvariableregion6.Productionofantibody基因工程与药物蛋白生产基因工程与药物蛋白生产抗体攻击病毒基因工程与药物蛋白生产凝集细菌基因工程与药物蛋白生产抗SARS的单抗SARS-CoV基因工程与药物蛋白生产抗体是对其抗原有极强专一性的魔弹或巡弋飞弹研究 以免疫转印法检测

特定抗原医疗 以毒素连结抗体攻击

病变細胞检验 以ELISA侦测特定

病原体基因工程与药物蛋白生产抗体生成技术基因工程与药物蛋白生产Epitope,Antigenicdeterminant

抗原决定簇Antigendeterminant●

一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇●

每个

抗原决定簇

至少诱生一种专一性抗体●蛋白质性

抗原决定簇

含有六个以上氨基酸基因工程与药物蛋白生产整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术

噬菌体抗体库技术

Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术基因工程与药物蛋白生产多克隆抗体polyclonalantibody基因工程与药物蛋白生产多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。

实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，胎盘球蛋白抗病毒感染等副作用：

超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点：特异性差。基因工程与药物蛋白生产传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴结B细胞基因工程与药物蛋白生产

传统抗血清的交叉反应专一性反应沒有反应交叉反应+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123基因工程与药物蛋白生产单克隆抗体Monoclonalantibody基因工程与药物蛋白生产单克隆抗体生成基因工程与药物蛋白生产可生产有用抗体的

淋巴细胞

若与

癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。癌细胞（myeloma）可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一个

Bcell只产生一种抗体

●

一个

B细胞只能生产一种抗体，对付某一

抗原決定簇。●

若有许多抗原決定簇，则需许多株

B细胞分別生产许多抗体。BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定簇1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾细胞+骨髓瘤细胞各抗体分开脾脏细胞骨髓瘤细胞基因工程与药物蛋白生产1234mmmm1234YYYYYYYYY基因工程与药物蛋白生产m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨基喋呤(A)(-)次黄嘌呤(H)\胸苷(T)TKHPRT

TK-HPRT-基因工程与药物蛋白生产

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定簇BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种

B细胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立的小鼠骨髓瘤细胞株由脾脏收集

B细胞抗原通常有多个抗原決定簇免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX基因工程与药物蛋白生产-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓瘤细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原基因工程与药物蛋白生产基因工程抗体GeneticEngineeringAntibody基因工程与药物蛋白生产基因工程与药物蛋白生产1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。基因工程与药物蛋白生产

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体基因工程与药物蛋白生产

克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性（immunogenicity）大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。基因工程与药物蛋白生产2鼠单抗可变区的人源化

尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR（complementarydeterminingregion）移植技术。

CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

基因工程与药物蛋白生产基因工程与药物蛋白生产

经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）。基因工程与药物蛋白生产

人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。

基因工程与药物蛋白生产

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。基因工程与药物蛋白生产

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。

小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;

分子小，穿透力强;

不含Fc，没有Fc带来的效应;

在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;

易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

3小分子抗体基因工程与药物蛋白生产FvScFv单域抗体（singledomainantibody）最小识别单位（minimalrecognitionunit）Fab基因工程与药物蛋白生产Fab-由完整的轻链和Fd构成Fv-由VH和VL构成ScFv-单链抗体VH和VL之间由一连接肽连接而成单域抗体

-仅由VH组成最小识别单位（MRU)

-由一个CDR组成

大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下

Fab进入周质腔（periplasmiccavity），装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab基因工程与药物蛋白生产

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽基因工程与药物蛋白生产

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。

基因工程与药物蛋白生产

单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;

在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;

如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。基因工程与药物蛋白生产

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是表达为包涵体（inclusionbody）或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;

二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到周质腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。基因工程与药物蛋白生产

即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。

(3)单域抗体VH基因工程与药物蛋白生产

约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。(4)最小识别单位CDR基因工程与药物蛋白生产4双特异抗体和多价抗体

双链抗体（Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

基因工程与药物蛋白生产

双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。

即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。基因工程与药物蛋白生产

Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结,形成双特异性抗体。基因工程与药物蛋白生产基因工程与药物蛋白生产RBS-ribosomebindingsite

所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。基因工程与药物蛋白生产基因工程与药物蛋白生产(associationdomain,AD)

抗体库技术(antibodylibrary)是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。

PCR技术;

免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达;

噬菌体表面展示文库技术。5抗体库技术基因工程与药物蛋白生产

初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。

基因工程与药物蛋白生产Xh–XheISp–SpeIE–EcoRISa–SaeIXb–XbaI它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与PⅢ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技术基因工程与药物蛋白生产

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phagesurfacedisplaysystem