深部真菌感染检验技术的研究进展

深部真菌感染检验技术的研究进展1.条件致病真菌感染危险因素国外：血液系统肿瘤病人—粒细胞减少、__骨髓移植器官移植ICUHIV感染国内：广谱抗生素应用ICU皮质激素糖尿病静脉插管2.美国院内血源性感染最常见的病原体(DianMicrobiolInfectDis,1998;30:121-129);Coagulase(-)staphylococciS.aureusEnterococcusspp.Candidaspp.EscherichialcoliKlebsiellaspp.Pseudomonasspp.3.真菌感染流行趋势…——探讨危险因素，了解病原菌类别病原菌种类：白念珠菌占首位、其次为热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。非白念珠菌的比例有所上升；曲霉感染在血液系统肿瘤患者中十分突出；其它少见菌深部感染引人注目。4.分离数■烟曲霉■其他曲霉19931994199519961997199819992000年图1994-1999年Defroit医学中心烟曲霉及非烟曲霉分离数(DiagMicrobiolInfectDis,2001;41:211-214)5.临床真菌学面临挑战——免疫功能受损患者的增加真菌感染日益严峻的问题病原菌种类不断变化，新出现的致病菌临床真菌工作者面临机遇和挑战6.研究生物学特性，准确鉴定病原菌探索诊断新方法，快速诊断真菌病药物体外疗效监测，提高治疗水平临床真菌学的任务7.系统性真菌感染的致病菌—条件致病菌—致病性双相真菌念珠菌组织胞浆菌曲霉球孢子菌隐球菌芽生菌接合菌马内青霉镰刀菌孢子丝菌暗色真菌酵母菌毛孢子菌枝顶孢霉8.了解特殊病原真菌生物学特性—形态学温度试验营养需求血清学特性分子生物学特性药敏特性毛孢子菌枝顶孢霉镰刀菌孢子丝菌马内菲青霉外瓶霉9.完成全基因序列测定的病原真菌白念珠菌新生隐球菌粗球孢子菌烟曲霉、构巢曲霉组织胞浆菌卡氏肺孢子虫10.真菌感染诊断新方法的应用11.真菌病诊断非培养方法乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原ELISA法检测念珠菌和曲霉抗原免疫组化、原位杂交技术用于深部真菌病诊断种特异性引物并应用于菌种鉴定——曲霉、外瓶霉、镰刀菌、孢子丝菌12.抗真菌药物体外药敏试验13.抗真菌药物的体外药敏试验意义确定药物抗菌谱检测菌株敏感性监测临床耐药菌株方法:测定最低抑菌浓度或杀菌浓度液基法:NCCLS固基法:E-test,ATB-Fungus14.体外抑菌试验结果的影响因素温度和孵育时间接种菌量培养基折点判定建立高重复性的的试验方法非常必要!15.NCCLS抗真菌药敏试验方案1982年NCCLS开始组织专家进行研讨1992年：NCCLSM27-P,酵母菌液基稀释法药敏测试标准化方法提案1995年：NCCLSM27-T，属试验性质1997年：NCCLSM27-A，属确认性质1998年：NCCLSM38-P，丝状真菌微量液基稀释法提案2003年：新版M38-A，产孢丝状真菌抗真菌药敏试验方案16.NCCLSM27-A方案酵母菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案〔ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofYeasts〕已批准的标准方法，包括微量稀释法〔microdilution)主要适用于：念珠菌和新生隐球菌17.NCCLSM38-A方案产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验方案〔ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofConidia-FormingFilamentousFungi〕提出的标准方法，微量稀释法(microdilution)主要适用于：曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克氏孢子丝菌〔菌丝相〕等。18.M38-A方案－菌悬液制备PDA，35℃纯化并活化：

--曲霉、波氏霉、米根霉和申克孢子丝菌：7天--镰刀菌：35℃

48-72h后转至25-28℃至7天

在分光光度计530nm波长通过,相当于McFarland0.5浊度,终浓度:0.4x104_5x104cells/ml19.分光光度计调整菌悬液浓度曲霉、申克氏孢子丝菌OD值调整至0.09-0.11〔80-82%透光率〕；镰刀菌、波氏假阿利氏霉以及根霉OD值调整至0.15-0.17〔68-70%透光率〕；然后以RPMI-1640液体培基稀释50倍；波氏假阿利氏霉接种悬液应以较低的〔50%〕稀释倍数接种；1：50稀释后得到2倍终浓度的接种悬液，其浓度为0.4-5×104CFU/ml；20.M38-A方案－孵育条件根霉：21-26hrs大多数菌种：46-50hrs波氏霉：70-74hrs21.M38-A方案－结果判定必须与生长对照比较按以下五级标准判断:4-生长无减少3-生长轻微减少,相当于对照的75%2-生长有明显的下降，相当于对照的50%1-仅有少量生长,相当于对照的25%0-无生长22.常用药物MIC值判定二性霉素B：MIC值判定为没有可见生长时的最低药物浓度；假设出现拖尾，临床上可能表现为耐药。氟康唑、酮康唑或氟胞嘧啶：MIC值判定为相对于生长对照有50%或更多的生长减少时的最低药物浓度。伊曲康唑及新三唑类：MIC值判定为100%抑制生长，时的最低药物浓度；对于曲霉属以及其它条件致病性丝状真菌出现拖尾时，可能反映临床上耐药。23.M38-A方案调整的几方面受试药物中增加了新型三唑类药物Posaconazole，Ravuconazole，Voriconazole；终点判读时将伊曲康唑的MIC值定义为100%生长受抑，其原因是伊曲康唑和其它新型三唑类药物，判读终点时不存在拖尾；质控菌株在原有近平滑念珠菌ATCC22021和克柔念珠菌ATCC6258的根底上，增加了参考菌株黄曲霉ATCC204304和烟曲霉ATCC204305；质控药物也有相应的增加。24.M-38-A质控株、参考株及其MIC值范围

菌株目的抗真菌药物MIC范围（µg/ml）MIC在此范围内的几率％近平滑念珠菌ATCC22019质控菌株二性霉素B氟康唑伊曲康唑酮康唑PosaconazoleRavuconazoleVoriconazole5－FC0.5－4.01.0－4.00.12－0.50.06－0.50.06－0.250.03－0.250.03－0.250.12－0.599.199.199.099.0克柔念珠菌ATCC6258质控菌株二性霉素B氟康唑伊曲康唑酮康唑PosaconazoleRavuconazoleVoriconazole5－FC1.0－4.016－1280.25－1.00.25－1.00.12－1.00.25－1.00.12－1.08.0－3299.599.194.0100.0黄曲霉ATCC204304参考菌株二性霉素B伊曲康唑PosaconazoleRavuconazoleVoriconazole0.5－40.2－0.50.06－0.50.5－40.5－4100.0100.0100.0100.0100.0烟曲霉ATCC204305参考菌株二性霉素B伊曲康唑0.5－20.12－1.0100.0100.0

25.MIC检测中存在的问题...如何与临床疗效相结合？--联合用药和耐药菌株问题如何简化方法并提高重复性？对不产孢真菌如何建立标准化方法？26.会议信息全国真菌感染学术研讨会2004年7月15-