第十二章阳性杆菌

第十二章

革兰阳性杆菌第一节炭疽芽胞杆菌

（Bacillusanthracis，B.anthraci)形态染色:致病菌中最大的G+杆菌两端平切、竹节状有毒株可有明显荚膜芽胞多在25～30℃有氧条件下形成椭圆形，小于菌体，位于菌体中央在培养基中、土壤内、动物尸体解剖后暴露在空气中，都易形成芽胞在活体及未解剖尸体内不形成芽胞二、微生物特性培养特性：需氧或兼性厌氧最适温度30～35℃普通培养基扁平、粗糙、不透明、灰白色、无光泽，边缘不整齐的菌落低倍镜下菌落边缘呈卷发状BAP：12～15h不溶血，18～24h轻微溶血其他需氧芽胞杆菌大多溶血明显而快速肉汤—絮状沉淀生长明胶表面液化成漏斗状，形成倒松树状NaHCO3BAP有毒株：产生荚膜，黏液型菌落，呈粘丝状(鉴别要点)无毒株：粗糙型菌落生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖有些菌能迟缓发酵甘油和水杨素产酸不产气水解淀粉、还原硝酸盐不产生吲哚和硫化氢、不利用柠檬酸盐、不分解尿素在牛乳中生长2～4天牛乳凝固→缓慢胨化触酶（+）、卵磷脂酶弱（+）菌体多糖抗原耐热、耐腐败，长时间煮沸仍能与特异性抗体发生环状沉淀反应（Ascoli热沉淀反应）特异性不高与毒力无关是多种植物凝集的受体

荚膜多肽抗原与毒力有关荚膜肿胀试验有鉴定意义荚膜抗体染色抗原构造芽胞抗原有免疫原性和血清学诊断价值炭疽毒素外毒素复合物保护性抗原（protectiveantigenPA）

致死因子（lethalfactorLF）

水肿因子（edemafactorEF）

单独皆无致病性具有抗吞噬和免疫原性要求快速检出、分离鉴定病原菌，以利早期确诊、查清疫源、及时治疗和采取预防对策三、微生物学检验标本的采集与处理皮肤炭疽：病灶深部标本肺炭疽：痰和血液肠炭疽：粪、呕吐物脑膜炭疽：CSF、血液死亡动物：严禁解剖，可消毒皮肤后割取耳朵、舌尖，采集少量血（心血），局限性病灶可取病变组织或附近淋巴结。无杂菌污染标本：直接接种肉汤增菌或固体培养基污染杂菌固体标本：加10倍量生理盐水充分浸泡，振荡10～15min、静置10min，取悬液65℃水浴30min或85℃5min，再增菌和培养污染杂菌液体标本：离心，弃上清液后，加0.5%洗涤剂振荡10～15min，离心取沉淀物增菌和分离培养生化反应噬菌体裂解青霉素抑制毒力试验检验程序皮毛、腐败脏器等血液Ascoli试验以NS制成悬液经加温或饱和尿素处理肉汤增菌培养BAP或戊烷脒平板2%兔血清肉汤4-8hG染色镜检菌落特征动力观察串珠试验确定报告荚膜肿胀试验涂片染色：G染色、荚膜染色、芽胞染色—初步报告荚膜荧光抗体染色核酸检测：核酸杂交分离培养：BAP、戊烷脒多粘菌素B平板2%兔血清肉汤增菌→分离培养形态和菌落特征生化试验:表12-1串珠试验:接种于含青霉素(0.05～0.5U/ml)的肉汤中，37℃6h，高倍镜下见大而均匀成串的圆球状菌体类炭疽无此现象鉴定试验青霉素抑制试验：接种于含青霉素5、10、100U/ml琼脂平板，37℃24h

生长受抑制不生长串珠和青霉素抑制联合试验：

噬菌体裂解试验：AP631炭疽噬菌体

NaHCO3毒力试验：接种于含0.5%NaHCO3和10%马血清的平板，10%CO2、37℃、24～48h黏液型菌落：有毒株粗糙型菌落：无毒株动物试验：小鼠、家兔或豚鼠皮下接种Ascoli热沉淀试验：可作追溯性诊断第二节蜡样芽胞杆菌

(Bacilluscereus,B.cereus)形态与染色：G+大杆菌生长6h后即形成圆形芽胞、位于菌体中心或次末端、不突出菌体菌体两端平截，多数呈链状排列多有周鞭毛、无荚膜二、微生物特性培养特性需氧或兼性厌氧营养要求不高最适温度30~35℃普通琼脂平板：菌落较大，灰白色，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状有蜡样光泽卵磷脂平板BAP—有β溶血卵黄平板—可分解卵磷脂而形成白色的混浊环，称乳光反应或卵黄反应生化反应能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素、糊精，产酸不产气能胨化牛乳，液化明胶，VP（+）、卵磷脂酶（+）多次传代后生化特性常可改变三、微生物学检验标本采集：可疑食物、粪便、呕吐物检验程序呕吐物、残留食物等活菌计数接种普通琼脂平板、BAP、卵黄平板37℃18-24h纯培养动物试验（肠毒素测定）生化反应血清凝集（分型）报告结果直接涂片染色镜检检验方法直接镜检分离培养与活菌计数普通琼脂平板、BAP、卵黄平板鉴定与分型：根据菌落特点、形态染色、生化反应等初步鉴定生化分型、血清分型、噬菌体分型，肠毒素检测第三节肉毒梭菌

（Clostridiumbotulinum,C．botulinum

）革兰阳性粗大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列，有时可见短链状，无荚膜。

20℃～25℃时形成椭圆形芽胞，粗于菌体，位于次极端，呈汤匙状或网球拍状厌氧培养生化反应随毒素型不同有所差异

主要生物学特性微生物学检查法标本及处理食物中毒患者：食物婴儿肉毒病患者：粪便食品卫生检样样品：发酵制品（豆瓣酱、臭豆腐等）粪便、食物等标本可先80℃加热10min，再厌氧培养毒素检查毒素检查（动物实验）毒素检出试验待测物精处理，腹腔注射小白鼠，约经数小时的潜伏期，出现肉毒中毒的典型症状，注射后数小时即可发病，24h内死亡，观察4d~7d。毒素确认试验直接注射试验组

煮沸15min对照组多价血清处理对照组毒素定型试验用A~G各单型及混合抗毒素分别处理样品，分别注射小白鼠，观察96h。

鉴定依据形态染色厌氧，能消化肉渣且变黑，产生恶臭味菌落边缘有皱褶毒素分型防治原则加强食品卫生管理和监督提高防范意识（低温保存食物，高温破坏毒素）尽早诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素第四节白喉棒状杆菌

(C.diphtheriae)

共同特征G+杆菌、一端或两端膨大成棒状染色不均匀，两端浓染或有异染颗粒无鞭毛、无芽胞排列不规则，呈栅栏状白喉棒状杆菌——致病菌类白喉棒状杆菌——条件致病菌二、生物学特性形态与染色:G+细长微弯的杆菌一端或两端膨大呈棒状常排列呈V、L、X等文字形异染颗粒——鉴别特征无荚膜、无芽胞、无鞭毛白喉棒状杆菌异染颗粒1000×Neisser染色孔雀绿染色培养特性需氧或兼性厌氧营养要求高，含血液、血清、鸡蛋的培养基吕氏（Loeffler)血清斜面或鸡蛋斜面BAP亚碲酸钾BAP吕氏（Loeffler)斜面含血清或鸡蛋：生长最快，6h即生长，10～12h长出灰白色、湿润、有光泽的光滑型菌苔/菌落菌体形态典型、异染颗粒明显，连续传代可保持形态和产毒性能不变BAP：菌落灰白色、光滑型、直径1～2mm、轻型有狭窄β溶血环多次传代后菌体变为球型亚碲酸钾BAP：黑色菌落各菌型还原能力不同（黑色或灰黑色）根据菌落特征及生化反应特点重型：2mm~3mm

、中心灰或黑、边缘锯齿状、不溶血、菌落结实

中间型＜1mm、灰黑色

、光滑、边缘整齐、不溶血、菌落中等结实

轻型1mm~2mm、深灰至黑色、边缘整齐、轻微溶血、菌落柔软液体培养基：菌型不同其生长特点也不相同重型：有表面菌膜及粗大颗粒沉淀、液体澄清中间型微细颗粒状，混浊，沉淀少或无轻型均匀混浊，有沉淀

生化反应：表12-2分解葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖产酸不产气，不分解乳糖、甘露糖，一般不分解蔗糖，吲哚（-）、硝酸盐还原（+）、触酶（+）、氧化酶（-）、明胶液化（-）尿素（-）重型能分解淀粉、糖原、糊精，迟缓分解蔗糖毒素不耐热外毒素最主要的致病性质三、微生物学检验标本采集：分泌物假膜的边缘咽喉部、鼻腔内分泌物或扁桃体粘膜上取双份如不能及时检验，标本浸于无菌生理盐水或15%甘油生理盐水保存分离培养，并证明其毒力毒力试验患者或带菌者咽喉、鼻咽拭子等直接涂片染色镜检（单染或G染色+异染颗粒染色）吕氏血清斜面35℃12～18h亚碲酸钾BAP、35℃24～48hBAP35℃16-18h涂片染色镜检(G染色和异染颗粒染色）观察菌落特点吕氏血清斜面生化反应涂片染色镜检检验程序直接涂片染色镜检2～3张→G染色、异染颗粒染色初报“直接涂片检出形似白喉杆菌”

分离培养吕氏血清斜面37℃、8～12h→→涂片染色镜检检出率↑，有助于快速诊断亚碲酸钾BAP37℃、24～48h，黑色菌落轻、中、重型BAP轻型有β溶血环，应注意与溶血性链球菌鉴别鉴定：形态染色、菌落特点、生化反应鉴别棒状杆菌属不同的种糖发酵试验、尿素酶、硝酸盐还原白喉：葡萄糖（+）、麦芽糖（+）蔗糖（-）毒力试验鉴定致病菌株的重要依据体外法琼脂平板毒力试验（Elek平板毒力测定）SPA协同凝集试验对流电泳体内法豚鼠皮内注射肉汤48h～72h培养物滤过液+NS→皮内注射肉汤48h～72h培养物滤过液+抗毒素→皮内注射锡克试验（Schicktest）白喉外毒素皮内试验致敏红细胞凝集试验测定血清中抗毒素水平第五节

分枝杆菌属

（mycobacterium）共同特征细长、略带弯曲的杆菌含分枝菌酸，有分枝生长的趋势不易着色，加温或延长染色时间

具抗酸性，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用需氧菌营养要求特殊大多数生长缓慢：≥7d个别菌种目前尚不能人工培养

（麻风分枝杆菌）二、生物学特性形态染色细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，单个、成堆或呈束状排列革兰染色不易着色抗酸染色阳性细胞壁外尚有荚膜

（染色时易损坏）无鞭毛、无芽胞细胞壁有很高的脂质含量

培养特性专性需氧菌最适37℃，低于30℃不能生长营养要求较高：必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上常用罗一琴（Lowenstein-Jensen，L-J）生长缓慢：2w~4w

菌落2w~4w干燥、粗糙、隆起、呈颗粒状、结节状或菜花状、乳白色或淡黄色，不透明在液体培养基生长较快，一般1w~2w即可生长管底生长→沉淀→菌膜有毒力菌株呈束状生长生化反应不活泼不发酵糖类触酶阳性热触酶阴性非结核分枝杆菌多为阳性硝酸盐还原试验、烟酸试验和烟酰胺酶试验阳性牛分枝杆菌则为阴性抗原性十分复杂有广泛的交叉性目前，没有一种血清学技术能提示分枝杆菌抗原的所有种类。抵抗力较强耐干燥本菌耐酸耐碱

对湿热敏感在70％～75％乙醇中数分钟即被杀死对紫外线的抵抗力弱

直射阳光下2h~7h可杀灭形态结构变异粗糙型（R型）→光滑型（S型）

毒力变异强→弱耐药性变异变异性三、细菌学检验（一）标本清晨第一口痰3ml~5ml

或一天晚至清晨咳出的全部痰无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液从溃疡处取脓汁或分泌物粪便尿液：收集24h混合尿痰标本前处理①酸处理法加入2~4倍的4%硫酸，液化，适用于接种碱性L-T②碱处理法加入2~4倍量2%氢氧化钠，该法适用于接种酸性L-J③胰蛋白酶—新洁尔灭法加入1~2倍量的0.1%胰蛋白酶消化，加入1/2量的0.3%新洁尔灭，新洁尔灭与标本的接触时间不能超过5min。④NaOH—NALC法加入等量NaOH—NALC消化液，处理后，加入PBS，离心，留沉淀其他标本前处理脑脊液、胸水、腹水离心，取沉淀接种取沉淀经2%~4%氢氧化钠处理，除杂菌尿液离心，取沉淀经2%~4%氢氧化钠处理脓液、伤口分泌物加酸或碱等处理（二）涂片染色镜检1）直接涂片薄片：取0.01ml涂抹10mm×10mm厚片：取0.1ml涂抹20mm×15mm2）集菌涂片：离心，取沉淀涂片汽油漂浮法齐一尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色染液初染液：碳酸复红脱色液：3%盐酸乙醇复染液：亚甲蓝稀释液注意事项初染需加热，不能沸腾，不能蒸干，冷却水洗脱色至红色刚好消退（不超过10min）

痰涂片要厚，观察至少100