DB4415-T 24-2023 甘薯病毒分子检测技术规程

65.020.20CCS

B

054415 DB4415/T

24—2023甘薯病毒分子检测技术规程Technical

for

detection

of

potato

2023-09-14

发布 2023-10-08

实施汕尾市市场监督管理局 发布DB4415/T

－2023 本文件按照

GB/T

—2020《标准化工作导则

第

1

部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定编写。本文件由汕尾市市场监督管理局提出并归口。本文件起草单位:

汕尾市农业科学院。本文件主要起草人:

林少钦。DB4415/T

－2023甘薯病毒分子检测技术规程1 范围及记录和归档。本文件适用于汕尾市区域内甘薯脱毒组培苗、原原种、原种以及生产用种的病毒分子检测。2 规范性引用文件文件。GB/T

6682

分析实验室用水规格和试验方法NY/T

脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程SN/T

2122

进出境植物及植物产品检疫抽样方法SN/T

2964

植物病毒检测规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1分子检测

molecular

detection以功能基因、核糖体、等区域为标靶，采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定。3.2引物

板DNA互补的序列。3.3聚合酶链式反应

chain

reaction在DNA体外复制出与母链互补的子链DNA的过程，是一项能快速特异性的在体外扩增目的DNA片段的技术。3.4逆转录聚合酶链式反应

reverse

transcription

chain

reaction以RNADNADNA为模板进行PCR性的检测目的的技术。DB4415/T

－20234检测对象4.1

a）甘薯类花椰菜花叶病毒（SPCV）b)

甘薯曲叶病（SPLCV）4.2

a)

甘薯褪绿矮化病毒（）b)

甘薯羽状斑驳病毒（）c)

G

病毒（SPVG）d)

甘薯潜隐病毒（SPLV）e)

甘薯褪绿斑病毒（）f)

甘薯脉花叶病毒（）g)

黄瓜花叶病毒（）5 抽样方法抽样方法应符合

SN/T

2122

和

SN/T

2964

中的规定，遵循随机的原则，根据样品的特性和样品中可能存在的病毒表现出的症状特点，确定取样方法、取样数量、取样工具、保存方法等。合适的取样计划，进行再次取样。6

6.1

聚合酶链式反应（）检测用于检测甘薯

病毒。6.1.1

试剂及缓冲液的配置试剂及缓冲液用水应符合

GB/T

6682

的规定，配置按

NY/T

执行。6.1.2

DNA

的提取样品

的提取按

NY/T

执行。6.1.3

对照组以

ddH2O

作为检测的阴性对照。6.1.4

引物a）甘薯类花椰菜花叶病毒（SPCV）:F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，，扩增产物

922

；b）甘薯曲叶病（SPLCVF-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，扩增产物

。6.1.5

PCR

扩增采用

病毒特异引物进行

PCR

扩增；反应体系（

μL）：样品总

DNA（约

ng/

μL）2

μL，2×Taq

Master

Mix

12.5

μL，上、下游引物（10

μmol/L

1

μL，ddH2O

补齐至

μL；扩增条件：DB4415/T

－202394℃

2

min；94℃

s，退火

s，68℃

1

，30

次循环；68℃

10

min；4℃

保存；扩增产物用于后续凝胶电泳检测。6.1.6

PCR

产物的电泳检测取

10

μL

PCR

扩增产物与

1

μL

10×loading

混合后，1%琼脂糖凝胶恒压（120

V～150

V）下电泳

20

min～30

min，EB

染色后，凝胶成像仪拍照观察。6.2

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测用于检测甘薯

病毒。6.2.1

试剂及缓冲液的配置试剂及缓冲液用水应符合

GB/T

6682

的规定，配置按

NY/T

执行。6.2.2

RNA

的提取样品

的提取按

NY/T

执行。6.2.3

对照组以

ddH2O

作为检测的阴性对照。6.2.4

引物a）甘薯褪绿矮化病毒（F-CGGTCARATTGGAAGGT，，扩增产物

；b）甘薯羽状斑驳病毒（F-GCATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，扩增产物

589

bp；c）甘薯

G

病毒（SPVGF-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，，扩增产物

1191

bp；d）甘薯潜隐病毒（SPLVF-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，扩增产物

1076

bp；e）甘薯褪绿斑病毒（）：F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，扩增产物

600

bp；f）甘薯脉花叶病毒（）：F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT

1015

；g）黄瓜花叶病毒（）:F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，，扩增产物

657

；6.2.5

反转录反转录过程按

NY/T

D.3.2

执行。6.2.6

PCR

扩增采用

病毒特异引物进行

PCR

扩增；反应体系（

μL）：合成的

cDNA

2

μL，2×Taq

Master

12.5

μL，上、下游引物（10

μmol/L）各

1

μL，2O

补齐至

25

μL；扩增条件：94℃

2

min；94℃

s，退火

45

s，68℃

1

，30

次循环；68℃

10

；4℃

保存；扩增产物用于后续凝胶电泳检测。6.2.7

PCR

产物的电泳检测取

10

μL

PCR

扩增产物与

1

μL

10×loading

混合后，1%琼脂糖凝胶恒压（120

V～150

V）下电泳

20