代谢控制发酵课件

代谢控制发酵

绪论第一节代谢控制发酵的

研究对象和任务

代谢控制发酵是发酵生理学的重要部分，是生物工程的重要专业基础课。它是利用遗传学或其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改变和控制微生物的代谢，使有用的代谢产物大量生成、积累的发酵技术。

一、几个概念

生理学（Physiology）工业微生物（InductrialMicrobiology）微生物生理学（MicrobiolPhysiology）发酵生理学(FermentationPhysiology)发酵(Fermentation)代谢调节控制（调控）(Metaboliccontrol)代谢控制发酵(Metaboliccontrolfermentation)生理学（Physiology）研究生物的功能的科学。按生物类别分为：人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学等分科。按生理学研究的观点和水平分有：比较生理学、器官生理学、细胞生理学和分子生理学。

工业微生物（InductrialMicrobiology）

是指在发酵工业上已经应用或具有潜在应用价值的微生物，它包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌也包括藻类和病毒。其范畴随科学技术的发展而不断扩大。

微生物生理学（MicrobiolPhysiology）

是微生物学的一个分支，是从生理生化的角度研究微生物细胞的形态、结构和功能以及微生物生命活动（及代谢）规律的学科。

发酵生理学(FermentationPhysiology)

是微生物生理学和生物工艺学（发酵工艺）的交叉分支，它是从生理、生化及发酵工艺角度研究工业微生物细胞的形态、结构和功能以及微生物生命活动（主要是代谢活动）规律的学科。

发酵(fermentation)

（1）早期的概念微生物在无氧时的代谢进程。有机物是通过另一个有机物还原而将自身氧化的生物学过程，脱氢体和受氢体均是有机物。（2）利用微生物生长和代谢活动生产多种有用物质。（3）利用微生物或通过细胞工程、酶工程、基因工程等获得的生命体生产各种有用物质。代谢调节控制（调控）

是研究生物体内生命物质相互制约、彼此协调及控制规律的科学。它的主要内容是揭示各类调节的分子基础，并阐明调节过程与机能相联系的机制。代谢控制发酵(MetabolicControlFermentation)

它是采用分子生物学、（基因重组技术）或其它生物化学的方法，人为地在DNA水平上，改变和控制微生物的特性，使有用的代谢产物生成和积累的发酵技术。

二、

代谢控制发酵的发展

——代谢工程

（Metabolicengineering)1.代谢工程定义

2.代谢工程研究的内容

3.代谢工程研究的任务

1.代谢工程定义

采用重组DNA技术和高精度的分析生物学技术相关的遗传学方法，进行精确目标的基因操作，改变微生物原由调节系统，实现提高目的代谢活性和目的代谢产物量。2.代谢工程研究的内容（1）在微生物体内建立新的微生物途径以获得新的代谢物（如链霉菌的聚乙酮）。（2）生产异源蛋白（如人体胰岛素，人血清白蛋白）（3）改变已存在的途径（如抗生素、工业酶、氨基酸、有机酸等的生产）

3.代谢工程研究的任务

对已知途径而言，是了解生物过程环境变化时对代谢流及其分布的影响，确定流向终产物的比例；对未知途径而言，是鉴别主要途径，了解副产物途径，以便指导遗传操作来克服微生物自身的遗传机制，去除副途径等。

代谢工程研究的目的

构建新的代谢途径，生产特定目的代谢物或具有过量生产能力的工程菌并应用于工业生产中。根据微生物的不同代谢特征，一般采用：（1）改变代谢流向（2）扩展代谢途径流量（3）构建新的代谢途径第二节发酵（工程）的发展和学习本课程的目的要求及参考书

一、发酵（工程）的发展沿革

二、研究对象

三、研究任务

四、目的要求五、主要参考书年或年代学科发展发酵技术(生物技术)发酵工业产品公元前10-30世纪

传统古老的天然发酵果汁堆放生酒,发酵原始啤酒、醋、酱、奶酪等1680显微镜的发明天然酿造酒、醋、酱、奶酪等1857证明发酵是由微生物作用，是酶的作用天然酿造酒、醋、酱、奶酪等1882-1887用固体培养基分离培养微生物纯种发酵（固体）酵母、酒精、丙酮-丁醇、淀粉酶、大小曲1909-1943青霉素的发现，链霉素的生产深层液体发酵抗生素、维生素、有机酸、酶制剂20世纪40年代生物化学的发展，酶化学的进步微生物转换甾族化合物（可的松等多种固醇类激素）20世纪50年代生物化学的发展，微生物遗传学的进步发酵的代谢调节氨基酸、核苷酸发酵20世纪60年代石油微生物的研究应用发酵原料的更换（石油发酵）石油蛋白及其它利用正烷烃和石油化工产品的发酵生产20世纪70年代微生物学及微生物遗传学的发展生物工程的发展利用固定化细胞（酶）进行发酵或制成生物传感器；利用细胞融合和基因重组技术进行育种，选育工程菌20世纪80年代微生物学的深入和应用蛋白质工程与新的代谢工程的发展利用定位突变技术和代谢调控原理，构建新的代谢途径，生产新的产品20世纪90年代学科交叉渗透，计算机广泛应用进入计算机自控的现代发酵工程氨基酸、核苷酸、生理活性物质、新药等一、发酵（工程）的发展沿革二、研究对象

研究的主要对象是为人类生产大量的抗生素、酶、氨基酸、有机酸、溶剂、醇类、多糖、维生素、蛋白质、生理活性物质、色素等有用产物的工业微生物及培养技术，主要是细菌、放线菌、酵母、霉菌等，当然现在又扩大到藻类、病毒、植物、动物等的培养技术。三、研究任务及内容

主要研究的微生物的生长、繁殖、发育、分化、代谢等生命活动的规律，以及和周围环境之间关系，从而控制工业微生物的生命活动（代谢途径），为提高发酵过程的生产、效率和创立新的发酵过程奠定理论基础。本课程讲授的主要内容：

1.微生物代谢

2.微生物代谢调节机制的分子基础

3.微生物代谢调节的模式

4.代谢调控理论在工业发酵上的应用——代谢控制发酵的实例四、目的要求

代谢控制发酵（微生物代谢调控学）是在微生物、微生物生理学、生物化学、分子生物学基础上开设的一门专业必（限）修课，它是复习巩固微生物、生物化学所学过的知识，加于深化提高。着重从代谢及代谢控制理论出发，有目的、人为地改造控制微生物的发酵过程，达到提高发酵水平和质量之目的。要求学生通过本课程学习，会灵活、巧妙地应用微生物生理及代谢控制的理论，去定向选育或改造原有菌种，选育优良性状微生物的科学思维的能力。具体要求，若选了这门课，希望能坚持下来，认真听课作好笔记，认真完成作业。主要参考书：1.张克旭等《代谢控制发酵》中国轻工业出版社19982.储炬等《现代工业发酵调控学》化学工业出版社20023.李季伦《微生物生理学》北京农业大学出版社19934.朱玉贤《现代分子生物学》高等教育出版社19975.孙乃思等《分子遗传学》南京大学出版社19906.沈萍等《微生物学》高等教育出版社19997.陶文沂等《工业微生物生理与遗传育种学》中国轻工业出版社1996

代谢控制发酵的基本思想——（微生物代谢的人工控制）

微生物在正常情况下，通过细胞内自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不少又不会过多的积累，而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，为此对微生物的代谢必须进行人工控制

。

人工控制微生物代谢的方法主要有两种：一、改变微生物的遗传特征二、控制发酵条件第一节

微生物生物合成途径的遗传控制图3-1谷氨酸棒杆菌鸟氨酸生物合成途径①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷氨酸醛脱氢酶④乙酰鸟氨酸转氨酶⑤NO乙酰谷氨酸O乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶⑥鸟氨酸氨甲酰基转移酶⑦精氨琥珀酸合成酶⑧精氨琥珀酸酶Arg对N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶有反馈调节作用。当选育瓜氨酸缺陷突变株（Cit-

），亚适量添加瓜氨酸（Cit

），就会积累大量的鸟氨酸。2、分支途径

（1）

例如：谷氨酸棒杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌的选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型（hom-）来积累大量Lys。

二、选育抗反馈调节突变株

所谓抗反馈调节突变株就是已解除了反馈调节作用的突变株

。在这些突变株中，因为反馈抑制或阻遏，或两者引起的自动调节作用已被削弱或解除，所以能合成较多的最终产物。

（一）选育抗代谢类似物的突变株（AnalogueResistanceMutant）

通常微生物生长需要各种代谢物。如维生素、嘌呤、氨基酸等。在正常情况下，代谢终产物如氨基酸A过量存在时，就会抑制或阻遏它自身生物合成酶。同时也能整合到蛋白质中去。只有当氨基酸A浓度足够高时，A与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，产生反馈抑制或阻遏作用。当细胞中的A参与蛋白质合成，而使细胞中A的浓度下降到一定程度时，A就会从调节酶的调节部位或阻遏蛋白上脱落下来，从而解除反馈调节，又重新可以合成新的A。当A的浓度再次上升到一定值时，反馈调节再次发生…….。

我们说代谢物和调节酶的变构部位或阻遏蛋白的结合是可逆的。而代谢类似物，结构类似物，即A′则不同，在培养基中添加A′其空间结构与A相似。当细胞中大量存在A′时，它也能和A一样与调节酶的调节部位或调节基因编码的阻遏蛋白结合，发生反馈抑制与阻遏作用。由于A′不能整合到蛋白质分子中去，细胞中的A′浓度不会自行下降。只要A′结合到调节酶的调节部位或阻遏蛋白上就不能脱落下来，这种结合是不可逆的。这样也就没有A的生物合成，氨基酸缺乏的细胞会因饥饿而死亡。因此代谢结构类似物对微生物细胞来说是有毒的，只要有结构类似物存在，菌种不会存活。

若我们通过诱导等手段获得突变株，已解除了终产物对酶的反馈调节，也就是说终产物A不再与调节酶的调节部位或阻遏蛋白结合。那么A的结构类似物A′也同样不再与调节酶的调节部位或胞质阻遏蛋白结合，也就是A′对菌株的毒害作用表现不出来，我们就说该菌株对A′有抗性。（resistance）我们常常将经过各种手段诱变的突变株放到含有终产物结构类似物A′的培养基上，挑出长出来的抗性菌株。若突变株抗A′性能越强（在含高浓度A′上长出来），则说明该菌株解除A对其生物合成系统的反馈调节就越彻底，那么A积累就越多。

根据上述原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能得到解除反馈抑制或阻遏的突变株。在这个意义上结构类似物抗性可以作为解除反馈调节菌株的“筛子”。除了氨基酸外还有嘌呤、嘧啶、维生素等的结构类似物。通过选育这些结构类似物菌株

，已获得氨基酸、核苷酸、核苷、维生素等各种代谢产物的高产菌株。

（二）从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中调节酶解除反馈抑制的突变株

调节酶的变构特性是由它的结构基因决定的，若调节酶因编码它的基因发生突变而失活，则有两种可能：

1、是编码为催化亚基与调节亚基的基因发生了变化。

2、仅仅是编码催化亚基（或活性部位）的基因发生变化。

若通过再次突变，使调节酶的活性恢复，这时又有两种可能：一是催化亚基和调节亚基恢复（或大体恢复）到第一次突变前那样的状态。另一种是催化亚基得到恢复，而调节亚基却丧失了调节作用，这情况实质上是编码调节亚基的DNA突变，解除了反馈抑制作用。调节酶的失活与否，可能直接表现为某种营养缺陷型。可以采用营养缺陷型的回复突变的方法，从营养缺陷型回复突变株中获得对途径中的调节酶解除反馈调节的调节突变株。

三、产物降解酶缺失突变株

为了使产物在发酵液中稳定地存在，以提高发酵单位，可通过诱变获得缺乏降解产物酶的突变株，其方法是诱变处理后，如图所示：

四、增加前体物的合成

通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体合成，有利于目的产物的大量积累。

五、细胞膜组分缺失突变株

第二节

生物发酵条件的控制（外因）

当菌株选育确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累。现以谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicacid）发酵为例来说明控制发酵条件包括O2浓度、NH4浓度、pH、磷酸盐浓度、生物素浓度等，环境条件改变，可使代谢转换方向，不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等产物。

表3-1环境因素对Glu产生菌

发酵的影响

第三节

代谢控制发酵实例一、丙酮酸的代谢控制发酵（一）丙酮酸用途及生产状况丙酮酸（pyruvicacid）又称a-氧代丙酸，a-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的a-氧代羟酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体。例如：治疗帕金森病的正多巴和L-半脱氢酸L-Leu、B6和B12的前体，也是合成氢化阿托酸，谷物保护剂等多种农药的前体，因此在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有广泛用途。

作为一种化工产品，丙酮酸早已实现工业化生产，但是直到20世纪90年代工业上生产丙酮酸还沿用HowardFraeer（1932）开发的酒石酸脱水脱羟法，没有多大改进，此法是将酒石酸+硫酸氢钾混合在220℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得丙酮酸，工艺简单易行。其主要缺点（1）丙酮酸产率较低（为酒石酒量的29～30%）。（2）得到1g丙酮酸需消耗5g硫酸氢钾，以目前(酒石酸1.5万元/吨,硫酸氢钾0.6万元/吨)市场价计算,仅原料成本至少需8万元/吨,为此在很长一段时间内,丙酮酸的价格居高不下,限制其推广应用。1995年国外一些研究机构发表丙酮酸钙在减肥保健上具有独特疗效的报道后，国外（主要是美国）对丙酮酸钙的需求量激活，刺激国内一些化工厂一拥而上，一时间国内丙酮酸（化学法）的生产能力达2000吨/年左右,丙酮酸及其盐的市场价由当时28万元/吨降低到9万元/吨。如何解决丙酮酸的市场需求不断扩大，但其价格又无法进一步下降这一矛盾呢？显然开发成本更低的丙酮酸生产技术，即采用直接发酵或生物转化法是解决此问题的根本出路。

尽管一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业生产要求而选育高产丙酮酸菌株十分困难，发酵法生产丙酮酸真正取得突破是1988年，日本东丽工业株式会社的研究人员宫田令子和米原撤选育出一系列丙酮酸产量超过50g/mL的球拟酵母菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1989年实现工业化发酵生产，其产酸率最高达67.8g/L。1992年日本开始采用发酵法生产丙酮酸产量为400吨/年,售价为4000日元/Kg。

（二）酵母代谢控制发酵生产丙酮酸

Ⅰ、丙酮酸脱羧酶（PDC）；Ⅱ、丙酮酸转氨酶（PT）；Ⅲ、丙酮酸羧化酶（PC）；Ⅳ、丙酮酸脱氢酶复合体（PDH）。NA和B1是丙酮酸脱氢酶系（PDH）的辅因子Bio是丙酮酸羧化酶（PC）的辅因子B6是丙酮酸转氨酶（PT）的辅因子B1是丙酮酸脱羧酶（PDC）辅助因子二、D-核糖代谢控制发酵（一）D-核糖发酵机制

（二）D-核糖发酵的代谢控制育种

1、出发菌株选择芽孢杆菌属的细菌转酮酸缺陷突变株积累D-核糖具有普遍性。而Ecoli属伤寒沙门氏等细菌的转酮酸缺陷突变株并不积累核糖，都采用芽孢杆菌属细菌。2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育）（1）选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株，因为D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必须通过磷酸戌糖途径进行代谢，若转酮酶发生缺陷，那样菌体自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。（2）选育莽草酸缺陷突变株（3）选育L-色氨酸-、L-酪氨酸-、L-phe-、CoQ-、Vk-或叶酸缺陷突变、莽草酸缺陷、4-赤藓糖合成受阻、转酮酶-、转醛酶-。3、其它标记

在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力，可使D-核糖大量积累。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属序细菌的孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2会发生分子型的变换，结果在菌体对生长期被诱导，导致D-核糖大量积累，若生孢子D-核糖减少。4、利用基因工程

日本岩木盾等人首先将枯草杆菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒PUB110中，然后将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活。经限制性内切酶Smal切后得到线状重组质粒，将该线状重组质粒转化到枯草杆菌宿主菌中，构建转酮酶失活的D-核糖工程菌株。其核糖产量达52g/L。小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到载体质粒PHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中去。构建扩增葡萄糖脱氢酶的D-核糖工程菌，350C发酵80h可积累49g/LD-核糖。

5、发酵控制

发酵培养基：碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、（NH4）2SO4、CaCO3。要在好气条件下，pH中性，温度370C

。

三、r-亚麻酸代谢控制发酵

（一）丝状真菌利用葡萄糖生物合成

r-亚麻酸的代谢途径(二)高产r-亚麻酸菌株的选育思路图3-9高产r-亚麻酸菌株的选育思路1、出发菌株

多采用被孢霉（Mortierella）毛霉（Mucor）红酵母（Rhodotorula）小克银汉霉（Cunninghamella）等产油脂高的真菌作出发菌株。2、切断或减弱支路代a-亚麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸-花生四烯酸L、二十碳五烯酸L3、解除反馈调节选育脂肪酸结构类似物，如（LTBr），耐高浓度的r-亚麻酸突变株。

4、强化能量代谢提高菌体细胞内ATP的水平有利于脂肪酸合成。选育呼吸抑制剂（丙二酸、氰化钾、亚伸酸等）抗性突变株。选育ADP磷酸化抑制剂（羟胺、2.4二硝基酚等）抗性突变株。选育抑制能量代谢的抗生素(寡霉素、结元氨霉素、制霉素)抗性突变株。5、增加前体

菌体生物合成γ-亚麻酸与HMP、EMP途径直接相关。增加HMP途径，NADPH的数量增多，有利于γ-亚麻酸产量的提高。过量的磷酸盐或通气不足会使EMP途径增强。而产生NADPH的HMP途径受阻，导致不饱和脂肪酸的合成降低。通过选育单氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突变株，均有助于γ-亚麻酸产量的提高。另据报道，选育异柠檬酸脱氢酶渗漏突变殊，也有利于γ-亚麻酸产量的提高。

6、选育△-6脱氢酶活力强的突变株

△-6脱氢酶是生物合成r-亚麻酸关键酶之一。其活性高低直接与r-亚麻酸含量的高低密切有关，可采用选育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增强型，通过诱变后菌株涂在含有TTC的一种无色的氧化还原剂的生长培养基上，若△-6脱氢酶强，即可将TTC还原成红色的物质，红色越强，表明菌体细胞内△-6脱氢酶越强，r-亚麻酸的积累量也就越多。

7．选育低温生长突变株细胞膜是重要的微生物细胞表面结构，由脂质和蛋白质组成。脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的沉动性也就越大，即微生物细胞生长的温度就越低。据报道，选育在相对低温(15℃)条件下生长良好的突变抹，结果其γ-亚麻酸的产量提高了1.4倍。

8．选育耐高糖的突变株在代谢控制发酵中，常采用耐高渗透压突变株。γ-亚麻酸发酵与培养基中糖浓度有密切关系，在一定范围内，γ-亚麻酸的产坠随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高就会抑制菌体生长。降低产物的积累。因此，通过选育耐高糖的突变抹。可使菌体高效率地利用葡萄糖，从而提高γ-亚麻酸的产量。四、柠檬酸代谢控制发酵

2001年以来世界柠檬酸的产量为100万吨左右，2004年我国柠檬酸产量达45万吨，其中80%出口，已经成为世界柠檬酸生产和销售大国。我国柠檬酸发酵水平：薯干粉产酸12%，发酵周期64h，转化率95%；玉米粉液化液产酸15%，发酵周期54～64h，转化率95%以上。(一)黑曲霉生物合成柠檬酸有机酸及多元醇途径1、葡萄糖氧化酶2、内酯酶3、己糖激酶或葡萄糖激酶4、P-葡萄糖异构酶

5、果糖运输6、己糖7、1-P-甘露（糖）醇脱氢酶8、1-磷酸甘露（糖）醇磷酸（酯）酶9、甘露（糖）醇运输10、磷酸果糖激酶11、醛缩酶12、丙糖-P异构酶13、3-P甘油醛脱氢酶14、丙酮酸激酶15、丙酮酸羧化酶16、草酰乙酸水解酶17、草酸运输18柠檬酸运输19、苹果酸脱氢酶20、三羧酸载体21、柠檬酸合成酶22、丙酮酸脱氢酶系1、葡萄糖化酶是胞外酶，直接受环境pH的影响。当pH＜3.5时,此酶失活,当一旦柠檬酸积累使pH降至1.8,从而导致葡萄糖氧化酶失活。2、草酸是由草酰乙酸水解酶的催化生成的，该酶是细胞质酶，草酰乙酸水解酶的生物合成也受外界pH值调节，尽管其调节机制现还没有搞清楚，但是研究表明诱导此酶的最适pH值为5～6，而当pH为2时，仅观察到非常低的酶活性。过去采用糖蜜，孢子接种发酵pH太低，不利于b孢子萌发，一般发酵前期控制pH5～6，因此存在少量的葡萄糖或草酸，现在我国采用淀粉质原料的液化液，并采用菌丝大接种量接种，再加上我国的黑曲霉产的糖化酶是耐酸的，因此当黑曲霉大量繁殖后，就产生柠檬酸，发酵液的pH是较低的。

3、多元醇（甘露醇、赤藓醇、丙三醇〈甘油〉）是由糖生成的，一旦糖类底物被耗尽，它们就会遭到再次分解，因此只要糖类底物最终能全部消耗多元醇就不可能是影响柠檬酸最终产量的主要因素。综上所述高产Aspnger柠檬酸产生菌应该在发酵中只生成柠檬酸。事实上，经天津工微所的研究表明，控制好发酵条件，我国柠檬酸产生菌的发酵液经低层析，只有一个柠檬酸斑点。

（二）黑曲霉生物合成柠檬酸机制

五、赖氨酸代谢控制发酵（一）赖氨酸生物合成途径及调节机制微生物合成Lys的途径主要有两种：1.在霉菌和酵母中的L-赖氨酸是经α-氨基己二酸途径：酿酒酵母：同型柠檬酸合成酶存在两种同功酶（HSⅠ，HSⅡ），它们都受Lys相同程度的反馈抑制，HSⅠ较易受L-Lys阻遏。薄膜假丝酵母：同型柠檬酸合成酶也存在两种同功酶，但只有HSⅡ受Lys反馈抑制。解脂复膜孢酵母：没有发现同工酶，其HS强烈受Lys反馈抑制。产黄青霉菌：同型柠檬酸合成酶受Lys和青霉素G的协同反馈抑制。

2、在细菌、蓝、绿藻中存在另一条重要的途径。是以天冬氨酸为起点，经二氨基庚二酸（DAP）生物合成L-Lys，称为天冬氨酸途径，亦称α-ε-二氨基庚二酸途径。

E.coli和黄色短杆菌，（谷氨酸棒杆菌等Glu产生菌）是研究较为深入的两类细菌，具有一定的代表性。在大肠杆菌合成Lys的天冬氨酸途径中，含有三种ASP激酶（AK）同功酶和两种高丝氨酸脱氢酶（HD）同功酶，每个同功酶受不同终产物的反馈调节，而且每个分支途径后的初始酶分别受各自产物的反馈抑制。如Lys分支途径第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）受Lys的反馈抑制等。然后在黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌等Glu生产菌中的关键酶AK却都是单一的，该酶受Thr+Lys的协同反馈抑制。此外还有以下与大肠杆菌不同：

(1)没有发现对ASP激酶（AK）或天冬氨酸半醛脱氢酶的反馈阻遏。

(2)Lys分支途径的第一个酶和第二个酶（二氢吡啶二羧酸合成酶与二氢吡啶二羧酸还原酶）既不受Lys的反馈抑制，也不受Lys的阻遏，这对Lys的积累十分有益。（3）未发现Lys脱羧酶，有利于生产Lys

综上所述可以采用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、北京棒杆菌等Glu产生菌选为出发菌株进行诱变或DNA重组技术选育高产Lys菌株。若采用DNA重组技术，因E.coli遗传背景研究较清楚，可以将产Lys的关键酶基因克隆到E.coli中，让其表达。(二)谷氨酸产生菌的赖氨酸生物合成调节机制图3-13乳糖发酵短杆菌赖氨酸生物合成的调节机制1、丙酮酸羧化酶2、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶3、天冬氨酸激酶4、DDP合成酶5、DDP还原酶6、高丝氨酸脱氢酶7、高丝氨酸激酶8、琥珀酰高丝氨酸合成酶9、苏氨酸脱氨酶1、优先合成：Met比Thr、Lys优先合成，Thr比Lys优先合成，HD酶活为PS酶活的15倍。2、AK受Thr+Lys协同反馈抑制3、Lys和Leu代谢互锁，PS受Leu阻遏4、乙酰CoA和取平衡合成5、Glu优于Asp合成(三)高产Lys菌株的育种思路（四）采用细胞工程和基因工程选育高产Lys菌株1.细胞融合选育高产Lys菌株高产乙醇的酵母菌的选育思路

——呼吸缺陷型突变株的筛选

如果你分离到一株啤酒酵母，其生长速度是已知生产菌株的二倍，因此你将其用于生产酒精的试验，但结果表明，该酵母株发酵葡萄糖的产物是酒精和其它产物的混合物，并且酒精产量只有现在生产菌株的50%。请你写出如何改造你新分离的酵母菌株，使其优于现有的生产菌株的方案。呼吸抑制发酵：在低糖0.2%酵母比生长速率0.1/h时，还是进行呼吸和生长的，而使其生长速率大大提高，因此可以筛选呼吸缺陷型突变株。

微生物代谢途径的调节模式

前边我们较详细地介绍代谢调节的机制，酶的合成和酶活性的调节机制，同时还介绍了化能异养微生物对有机化合物分解代谢和合成代谢的途径，微生物是怎样调节这些代谢途径的？有那种调节模式？第一节反馈抑制和阻遏（feedbackinhibition，feedbackrepression）

一、反馈抑制和阻遏的概念在微生物细胞中，初级代谢产物的水平，也就是分解代谢和合成代谢的途径主要受反馈控制体系的调节，主要有反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制（feedbackinhibition）：是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应（通常是第一个反应）的酶活力的抑制，其实质是终产物结合到酶的变构部位，从而干扰酶和它底物的结合，当然与此相反为酶活性的激活。反馈阻遏（feedbackrepression）：是指终产物（或终产物的结构类似物）阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成，其实质是调节基因的作用，这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施，当然与此相反有酶合成的诱导。二、反馈抑制与反馈阻遏的比较反馈抑制或激活，不涉及到蛋白质（酶）合成过程，比较直接而快、当终产物浓度或底物浓度达到一定水平时，即使酶活性暂时丧失（或提高），待最终产物的浓度降低（或底物耗尽）后，酶活力又重新恢复（或降低）。反馈阻遏（诱导）是对酶合成的阻遏（促进）所以其效果不如反馈抑制那样迅速，但可以节约原料，对微生物来说是经济的。第二节影响酶活性的调节方式例如：乳糖发酵短杆菌的AK酶受Thr和Lys的增效抑制。

从以上图可看出：乳糖发酵短杆菌中，AK酶受Thr和Lys单独过量各自的反馈抑制。当Thr和Lys同时过量时，对AK酶的抑制比Thr、Lys两者单独过量时发生的抑制之和还要大。3、终产物的累积性抑制（cumulatireinhibition）判别特征是：任一终产物单独过剩时，能独立地对共同途径的一个多价变构酶产生部分反馈抑制（某个百分比抑制），并且各终产物的反馈抑制作用互不影响，指既无协作也无对抗。当多种终产物同时过剩时它们的反馈抑制作用是累积的。例如Ecdi中的谷氨酰胺合成酶（GInS）受8种化合物的累积抑制。

例如枯草杆菌芳香族氨基酸合成就是这种调节。（1）第一步DAHP缩合酶是三种同工酶催化，每种同工酶受其各自的终产物抑制。（2）莽草酸激酶受分支酸和予苯酸的反馈抑制。（3）预苯酸脱水酶受苯丙氨酸反馈抑制。（4）预苯酸脱氢酶受赖氨酸反馈抑制。（5）邻氨基苯甲酸合成酶受Trp过量的抑制。例如：E.codi中ASP族氨酸合成途径中AK为三个同功酶，HD为两个同功酶。

因此要完全解除终产物的反馈调节，所有终产物都应很少，这对我们打破其代谢调节使Lys、Met、Thr、Ile大量积累带来困难。例如谷氨酸棒杆菌的Asp族氨基酸合成代谢途径中第三节影响酶分子数量的调节方式

影响细胞内酶分子数量的因素很多，酶的阻遏和诱导，细胞分裂，酶分子的降解等都会使酶分子数改变，但主要调节方式是阻遏、诱导。

L-Thr是Ile的前体，丙酮酸是缬氨酸的直接前体（a-酮异己酸是Leu的前体）。这三种氨基酸合成中有4种酶是共用的，特别是分支链氨基酸转氨酶是三种氨基酸合成都需要。这些共用酶受Ile、Val、leu的阻遏。

微生物的代谢第一节微生物的代谢体系

一、微生物代谢体系代谢（Metabolism）是细胞内发生的各种化学反应的总称，它主要由分解代谢（Catabolism）和合成代（Anabolism）两个过程组成。

分解代谢合成代谢

总之，微生物的代谢体系主要有：（1）分解代谢体系（2）结构单位物质合成体系（3）复杂生物大分子物质的合成体系

二、三种主要代谢体系的联系

1.体系Ⅰ产生的ATP供给体系Ⅱ和Ⅲ使用，但体系Ⅰ中ATP如何合成并不严重影响体系Ⅱ、Ⅲ对ATP的使用。从这个意义上讲可以认为体系Ⅰ与整个合成体系（包括体系Ⅱ和Ⅲ）之间的联系较为松散。

2.体系Ⅰ合成的小分子化合物可用作体系Ⅱ中结构单位的碳架，其质和量强烈地影响体系Ⅱ的运行，因此体系Ⅰ和Ⅱ的联系是紧密的，而体系Ⅰ与Ⅲ之间几乎只通过ATP相联系。因此它们之间的联系是松散的。结构单位（如氨基酸）在细胞内常以游离状态存在，由此推测体系Ⅱ和Ⅲ也只是保持松散关系。3.既然体系Ⅰ和Ⅱ分别与体系Ⅲ只发生松散联系，体系Ⅰ就具有相对独立的运转能力，同时体系Ⅰ和Ⅱ可作为一个整体，具有相对独立的运转能力。4.由于细胞的分泌机制，体系Ⅰ的相对独立运转使细胞有可能分泌如乙醇等代谢副产物；体系Ⅰ和Ⅱ一起相对运转，使细胞有可能分泌氨基酸等生物大分子的前体。

三个体系协调运转，不但使微生物细胞生长迅速，而且有可能分泌酶、多糖等生物大分子。

在代谢过程中，微生物通过分解代谢产生化学能，光合微生物还可将光能转换成化学能，这些能量除用于合成代谢外，还可用于微生物的运动和运输，另有部分能量以热或光的形式释放到环境中去。某些微生物在代谢过程中除了产生其生命活动所必需的代谢产物和能量外，还会产生一些次级代谢产物。这些次级代谢产物除了有利于这些微生物的生存外，还与人类的生产与生活密切相关。三、化能异养型微生物碳架物质

的代谢流向

第二节微生物产能与耗能代谢

一、微生物的产能代谢

（一）异养微生物的生物氧化异养微生物氧化有机物的方式，根据氧化还原反应中电子受体的不同可分为发酵和呼吸。

1、发酵（Fermentation）

微生物发酵葡萄糖最为重要，有机物只是部分被氧化，如葡萄糖丙酮酸，称为糖酵解（Glycolysis），主要有四种途径。（1）EMP途径（2）HMP途径（3）ED途径（4）磷酸解酮途径EMP途径主要生理功能是：1、提供ATP和NADH2、产生中间产物又可提供微生物合成代谢的碳骨架3、可逆转合成多糖（2）HMP途径

是从葡萄糖-6-P开始，即单磷酸己糖基础上开始降解，故亦称为单磷酸己糖途径，磷酸戊糖支路（HMP途径中3-P-甘油醛可以进入EMP途径）。HMP途径的一个循环最终结果是：

一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力NADPH和中间代谢产物，如核酮糖-5-P是合成核酸、某些辅酶及组氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、类固醇和谷氨酸的供氢体。另外，核酮糖-5-P还可以转化为核酮糖-1,5二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2，对于光能自养菌，化能自养菌具有重要意义。虽然这条途径中产生的NADPH可经呼吸链氧化产能，1mol葡萄糖经HMP途径最终可得到35molATP，但这不是代谢的主要方式，不能把HMP途径看作产生ATP的有效机制。（3）ED途径

ED途径是在研究嗜糖假单胞菌（PseudomonasSaccharophila）时发现的，在ED途径中，葡萄糖-6-P首先脱氢产生葡萄糖酸-6-P，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生一分子甘油醛-3-P和一分子丙酮酸，然后甘油醛-3-P进入EMP途径转变成丙酮酸。一分子葡萄糖经ED途径最后生成两分子丙酮酸，一分子ATP，一分子NADPH和NADH。ED途径在G-菌中分布较广泛，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌株较多存在。ED途径可不依赖于EMP,HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化类的ATP的厌养菌而言，ED途径不如EMP途径经济。

（4）磷酸解酮途径

磷酸解酮途径是明串珠菌在进行异型乳酸发酵过程中分解己糖和戊糖的途径。该途径的特征性酶是磷酸解酮酶。根据解酮酶不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的称PK途径，把具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途径。

2、呼吸作用

微生物在降解底物过程中，将释放出电子传给NAD（P）+FAD或FMN等电子载体，在经电子传递系统传给外源电子受体，从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程称为呼吸作用。

（1）有氧呼吸以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（Aerobicrespiration）。呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物，而是交给电子传递系统，逐步释放出能量后，再交给最终电子受体。

许多不能被发酵的有机化合物能够通过呼吸作用被分解，这是因为在进行呼吸作用的生物电子传递系统中发生了NADH的再氧化和ATP的生成。因此，只要生物体内有一种能将电子从该化合物转移给NAD+的酶存在，而且该化合物的氧化水平低于CO2即可。能通过呼吸作用进行分解的有机物包括某些CH化合物、脂肪酸、许多醇类。但对人造化合物，PVC、PP等微生物的呼吸作用具有显著抗性，可在环境中积累，造成有害的生态影响。

根据原核生物与真核生物不同，葡萄糖完全氧化总共可获得36或38个ATP.

在TCA循环中丙酮酸完全氧化为3个CO2同时生成4分子NADH2和一分子FADH2。NADH、FADH2可经电子传递系统全部被氧化。氧化一个NADH生成3分子ATP，氧化FADH2生成2分子ATP，再加上琥珀酰CoA氧化成延胡索酸中，包括底物水平磷酸化作用，由此产生1分子ATP，因此每一次TCA循环可获得4×3+1×2+1=15ATP。此外，糖酵解过程中产生2分子NADH，即2×3=6ATP。葡萄糖转变为两分子丙酮酸还可借底物水平磷酸化生成两分子ATP。因此，葡萄糖完全氧化总共可获得6+2+15×2=38ATP，假设ATP高能磷酸键有31.8KJ/mol的能量，那么每1mol葡萄糖完全氧化成CO2和H2O时就有31.8×38=1208KJ的能量转变为ATP中的高能磷酸键的键能，因此完全氧化1mol葡萄糖可获得的总能量大约是2822KJ，因此呼吸作用的效率大约是43%，其余的能量以热的形式散失。

（2）无氧呼吸

以氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（Anaerobicrespiration）某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是像NO3-、NO2-、SO42-、S2O32-、CO2等这类外源受体。无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。但由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。

在无氧条件下，某些微生物在没有氧、氮或硫作为呼吸作用的最终受体时，可以磷酸盐代替，其结果是生成磷化氢PH3，一种易燃气体。当有机物腐败变化时，经常会发生这种情况。若埋葬尸体的坟墓封口不严时，这种气体就很易溢出。农村的墓地通常位于山坡上，埋葬着大量尸体，在夜晚，气体燃烧会发出绿幽幽的光。长期以来人们无法正确地解释这种现象，将其称为“鬼火”。

（二）自养（以无机物CO2为唯一或主要碳源）微生物的生物氧化

一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类微生物称为化能自养微生物。它们在无机能源氧化过程中主要通过氧化磷酸化产生ATP。

氨的氧化NH3、NO2-亚硝酸硝酸亚硝化细菌

硝化细菌

硫的氧化H2SS亚硫酸盐氧化

硫氧化酶细胞色素系统产生4ATP直接氧化

磷酸腺苷硫酸氧化途径

铁的氧化

亚铁的氧化仅在嗜酸性的氧化亚铁硫杆菌中进行，在低pH下此菌能利用亚铁氧化放出的能量生长。在该菌的呼吸链中发现了一种含铜蛋白质，它与几种细胞色素C和一种细胞色素a1氧化酶构成电子传递链，尽管电子传递过程中的放能部位，和放出有效能的多少有待进一步研究，但已发现在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成。

氢的氧化

氢细菌都是一些呈G-兼性化能自养菌。它们能利用分子H2氧化产生能量同化CO2，也能利用其它有机物生长。氢细菌的细胞膜上有泛醌、维生素K2及细胞色素等呼吸链组分。在该菌中，电子直接从H2电子传递系统，电子在呼吸链传递中产生ATP。在多数氢细菌中，有两种与氢氧化有关的酶。（1）是位于壁膜间隙或结合在细胞质膜上的不需NAD+的颗粒状氧化酶，它可催化

H22H++2e-

。该酶在氧化氢，并通过电子传递系统传递电子过程中可驱动质子的跨膜运输，形成跨膜质子梯度为合成ATP提供动力。

（2）是可溶性氢化酶的氧化，而使NAD+还原的反应。所生成的NADH主要用于CO2的还原。

（三）能量转换

1.底物水平磷酸化（SubstrateLevelPhosphorylation）物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称底物水平磷酸化。2.氧化磷酸化（OxidatirePhosphorylation）物质在生物氧化过程中，形成NADH和FADH2可通过位于线粒体内膜和细胞质膜上的电子传递系统将电子传递给氧或其它氧化型物质。在这个过程中偶联着ATP的合成，这种产生ATP的方式称为氧化磷酸化。3.光合磷酸化（Photophosphorylation）光合磷酸化是指光能转变为化学能的过程，以用于从CO2合成细胞物质。当一个叶绿素分子吸收光量子时，叶绿素性质上即被激活，导致叶绿素（或细菌叶绿素）释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中的传递过程中逐步释放能量，这就是光合磷酸化的基本动力。（1）环式光合磷酸化（2）非环式光合磷酸化

二、微生物的耗能代谢

（一）细胞物质的合成

微生物利用能量代谢产生的能量、中间产物以及从外界吸收的小分子合成复杂的细胞物质的过程称为合成代谢。合成代谢所需的能量由ATP和质子动力提供。糖类、氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶等主要细胞成分的合成反应的生化途径中，合成代谢和分解代谢尽管存在共同的中间代谢物。例如由分解代谢产生的丙酮酸、乙酰CoA、草酰乙酸、3-P甘油醛等化合物亦可作为合成反应的起始物。（1）生物合成途径中一个分子的生物合成化学途径与它的分解代谢途径通常是不同的，其中可能有相同的步骤，但导向一个分子合成的途径与从该分子开始的降解途径间至少有一个酶促反应步骤是不同的。（2）需能的生物合成途径与产能的ATP分解反应相偶联，因而生物合成方向是不可逆的。（3）调节生物合成的反应与相当的分解代谢途径的调节机制无关，因为控制分解代谢途径速率的调节酶，并不参与生物合成途径。生物合成途径主要是被它们的末端产物浓度所调节。

1、CO2固定

CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物也能利用CO2作为辅助的碳源。将空气的CO2同化成细胞物质过程，称为CO2的固定作用。微生物有两种同化CO2的方式，（1）是自养式，（2）为异养式。在自养式中，CO2加在一个特殊的受体上，经过循环反应，使之合成糖并重新生成该受体。在异养式中CO2被固定在某种有机酸上。因此异养微生物即使能同化CO2，最终却必须靠吸收有机碳化合物生存。自养微生物同化CO2所需的能量来自光能或无机物氧化所得的化学能，固定CO2的途径主要有以下三条：

（1）卡尔文循环（Calvincycle）

化能自养微生物和大部分光合细菌中。

（2）还原性TCA环固定CO2

在光合细菌、绿硫细菌中发现此途径

每循环一次可固定四分子CO2，合成一分子草酸乙酰，消耗3分子ATP，两分子NAD（P）H和一分子FADH2。

（3）还原的单羧酸环

这个体系与还原羧酸环不同，不需ATP，只要有Fd（red）就可运转，Fd（red）由H2或NADH2提供电子生成。光合细菌也可利用此途径体系把CO2转换成乙酸。

异养型微生物同化CO2

异养型微生物的CO2固定主要是合成TCA环中间产物。从理论上讲，利用1分子草酸乙酰就可以不断地推动TCA环的运行（因为草酸乙酰可通过TCA环再生）。假如TCA环中的中间产物被用作它用，那么就须加以补充，才能维持TCA的正常运行。异养型微生物固定CO2生产二羧补充TCA环的中间产物主要有以下反应。

毫无疑问以上六种酶，并不同时存在一个有机体中。例如肠杆菌科中就以磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为主催化CO2，而黑曲霉柠檬酸产生菌中就以丙酮酸羧化酶为主催化CO2。

2、生物固氮

所有生物都需要氮，氮的最终来源是无机氮。尽管大气中氮气的比例占79%，但所有的动植物以及大多数微生物都不能利用分子态氮作氮源。目前仅发现一些特殊类群的原核生物能将分子态N2还原NH3，然后再由氨转化为多种细胞物质。微生物将氮还原成氨的过程称生物固氮。

微生物之所以能够在常温压条件下固氮，关键靠固氮酶的催化作用。固氮酶的结构比较复杂，由铁蛋白和钼铁蛋白连两个组分组成。固氮作用是一个耗能反应，固氮反应必须在有固氮酶和ATP参与下才能进行。每固定1mol氮大约需要21molATP，这些能量来自氧化磷酸化或光合磷酸化。在体内进行固氮时还需要特殊的电子传递体，主要是铁氧还蛋白和含有FMN作为辅基的黄素氧还原白。铁氧还原蛋白和黄素氧还原蛋白的电子供体来自NADPH，受体是固氮酶。3、二碳化合物的同化

TCA环是产能反应和生物合成的重要代谢环节，其中的有机酸可被微生物利用，作为电子的供体和碳源。四碳、五碳、六碳酸均可在有氧条件下被微生物利用，通过氧化磷酸化产生能量。TCA环只有在受体分子草酰乙酸在每次循环后都能得到再生的情况下才能顺利进行。若将TCA中的有机酸分子移作他用（生物合成）将会影响TCA环的运转。我们知道微生物可利用回补途径（Replenishmentpathway）来解决这个矛盾。什么是回补途径？是指补充兼用（可）代谢途径（如TCA环）中因合成代谢而消耗的中间代谢产物的反应。

不同微生物以及在不同条件下具有不同的回补途径，总起来主要有：（1）CO2的固定反应CO2的固定反应上面已介绍不重复。（2）乙醛酸循环

（3）甘油酸途径

乙醛酸途径甘油酸途径

由乙醛酸生成甘油酸的途径称为甘油酸途径。许多微生物都有这条途径，可以利用乙醇酸、草酸、甘氨酸等二碳化合物为唯一碳源生长。

4、糖类的合成

5、氨基酸的合成

6、核苷酸的合成

（1）嘌呤核苷酸的生物合成（2）嘧啶核苷酸的生物合成（3）

嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸的补救合成途径

（4）脱氧核苷酸的合成

（1）嘌呤核苷酸的生物合成

（2）

嘧啶核苷酸的生物合成

（3）

嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸的补救合成途径

（4）脱氧核苷酸的合成

脱氧核苷酸是由核苷酸糖基第2位碳上的-OH还原为H而成的，是一个耗能过程。E.coli核糖核苷二磷酸水平上脱氧德氏乳酸菌核糖核苷三磷酸水平上脱氧DNA的胸腺嘧啶脱氧核苷酸是在形成尿嘧啶脱氧核糖核苷二磷酸后脱去磷酸，再经甲基化生成的。（二）其他耗反应

1.运动鞭毛运动鞭毛纤毛中均具有ATP酶，水解ATP产生自由能成为运动所需的动力。2.运输营养物质的跨膜运输有四种机制。扩散、促进扩散、主动运输(需要消耗能量)、膜泡运输(需要消耗能量)。

3.发光

许多活的生物体，包括某些细菌、真菌和藻类都能发光。尽管它们的发光机制不同，但在所有例子中，发光都包含能量的转移，是形成一种分子激活态，当这种激活态返回基态时即发出光来。

细菌发光涉及两种特殊成分（1）荧光色素酶（2）一种长链脂肪族醛。另外黄素单核苷酸和氧参与，NADPH是主要电子供体。

微生物的代谢调节机制第一节微生物细胞中代谢调节的

部位与举措

一、原核微生物细胞的代谢调节部位

（一）与细胞质膜密切相关的调节

1.膜的脂质（磷脂及其它脂类）的分子结构，以及环境条件（如离子强度、温度、pH等）对膜脂质理化性质的影响。2.膜蛋白（如酶、载体蛋白、电子传递链的成员及其它蛋白质）的绝对数量及其活性的调节。3.跨膜的电化学梯度以及ATP、ADP、AMP体系及无机（P）浓度对溶质输送的调节。4.细胞壁结构（特别是骨架结构）的部分破坏或变形，间接影响到膜对溶质的通透性。

（二）细胞空间内存在的酶分子的数量及它们活性的调节

1.微生物可改变生物合成代谢途径中的酶量，特别是关键酶合成或降解的相对速率，进而调节代谢流向。

2.可改变酶的活性，特别是关键酶的活性（力）来调节代谢速度。

3.酶和底物的相对位置

限制酶与基质的有形接触（代谢途径的区域化）

二、真核微生物细胞的代谢调节部位

三、原核生物和真核生物在

基因表达上的重要区别

四、生物进化与代谢调节机制的出现（1）

酶水平的调节（2）

细胞水平的调节（3）

激素水平的调节（4）

神经水平的调节五、微生物细胞的代谢调节的主要举措

1.

酶合成的调节

2.

酶活性的调节

3.

能荷的调节

4.细胞膜透性的调节

第二节酶合成的调节机制

酶合成调节机制主要有：

1.酶的诱导负向控制（如乳糖对β-半乳糖苷酶）与正向控制。2.终产物阻遏作用和弱化调节。3.分解代谢物阻遏（如葡萄糖对β-半乳糖苷酶的阻遏）。4.转录后的调节。

一、诱导作用（酶合成的诱导作用）

是指培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中相应酶的合成速率。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。（一）诱导机制（操纵子转录）

1.操纵子（元）Operen

所谓操纵子（元）是指结构上、功能上、协同作用的相关基因组成的一个片段（区域）。操纵子假说认为：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。

每个操纵子（元）至少由4个基因（部分）组成。（1）调节基因（R.I.C）（Regulatorygene)（2）操纵基因（Operatorgene）

（3）结构基因（Structuralgene）

（4）启动基因（Promotergene）（1）调节基因（R.I.C）（Regulatorygene)

它能编码、调节（阻遏）蛋白，现发现有两种调节蛋白：

1.阴性（负作用）调节蛋白（Negatire-actingprotein），此种调节蛋白也称为阻遏物（Repressor）。

2.正作用调节蛋白（Positire-acting-protein）,此种调节蛋白也称为激活因子（Actiration）。

（2）操纵基因（Operatorgene）

是操纵子中一个成员，它能控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因可受调节基因产生的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或一个以上（多个）结构基因。

（3）结构基因（Structuralgene）

是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在一个或多个基因，它编码不起调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。一部分结构基因的RNA合成速度精确地被控制，但许多结构基因以一种（或多或少）不变的速度持续地转录DNA上的遗传信息，生成相应的信使RNA（mRNA）进而转译成特定的酶（蛋白质）。（4）启动基因（Promotergene）

启动子（基因）含有两个和RNA多聚酶结合的顺序，一个集中在RNA多聚酶起始位置前约10个碱基对，另一个则集中在这个位置前35个碱基对，当RNA多聚酶与启动子接触并结合上去，mRNA合成即开始。如阻遏物（阻遏调节蛋白）与Operatorgene结合，则RNA聚合酶就不能和Operatorgene结合，就不能向前移动，也就不能转录出互补于结构基因（S）的DNA顺序的mRNA。也就没有酶的生成。而在E.coli中启动基因必须经过（环化AMP受体蛋白复合物）的激活后，才能启动。

这些基因形成整套调节控制机制，才能使生命系统在功能上有序、有效及开放。

2、

DNA与蛋白（阻遏蛋白）的结合

蛋白质与核酸的相互作用一般可分为非专一性，蛋白质可以结合到核酸的任何部位；专一性，蛋白质结合到特定的核酸的部位。

(二)酶合成的诱导（转录的负控诱导和正控诱导）实例及机制实例

（1）酶合成的负诱导机制（大肠杆菌乳糖操纵子）

（2）转录的正控诱导麦芽糖操纵子

机制转录的正负诱导调控

当大肠杆菌细胞以阿拉伯糖作为生长所需碳源和能源时，它们产生三种将阿拉伯糖转化为木酮糖的酶。

图2-12阿拉伯糖对ara操纵子araC位点的调控作用

（三）诱导物的种类

诱导分解代谢酶类属于诱导酶的范畴。例如，淀粉酶是由淀粉诱导合成的，蔗糖酶与脲酶分别由蔗糖和尿素诱导。细胞在代谢过程中生成的产物也可以作为诱导物。荧光假单孢菌在色氨酸大量存在时。色氨酸的代谢产物——犬尿酸便可诱导分解色氨酸的酶系。

（四）诱导调节的克服

只有需要时才合成所需的酶是微生物应有的、正常的调节机制。如不设法绕过这种机制，就难于使所需要的诱导酶大量生产。据此，我们可采用诱变方法，借强力因素诱变，引起突变，消除诱导酶，合成所必需依赖诱导物这种障碍，如突变不是发生在结构基因上，而是发生在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码的阻遏物（阻遏蛋白）无活性，或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能产生诱导酶，这种突变作用称为调节性或组成型突变。具有这种特性的菌株称为组成型突变株。组成型突变株的获得、富集方法。

1.在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选。

2.将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养。

3.使用诱导性能很差的基质。

4.使用阻碍诱导作用的抑制剂。

5.提高筛选效率的方法，即组成型突变株的富集。

二、酶合成的阻遏和弱化（终产物的阻遏、弱化）实例及机制(一)实例

(1)转录的负控阻遏

L-色氨酸操纵子的结构

图2-14大肠杆菌trp操纵子

trpoperon阻遏系统——终产物的阻遏机制

(2)转录的衰减（弱化作用）

弱化子随着对trpoperon

的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致。例如，在高浓度和低浓度下观察到，trpoperon的表达水平相差约600倍，然而阻遏作用只可使转录减少70倍。，显然trpoperon表达的这种控制与上述阻遏物的控制无关，必须有一种称为弱化作用的调控机制。这个前导区域称为弱化区域，这个前导肽称为弱化子。

（二）机制

(1)转录弱化作用的调控

A.当trp缺乏时（低水平的trp时）

B.Trp浓度很高时（2）阻遏作用和弱化作用的区别与协调

A.区别可阻遏操纵子的表达：在无阻遏物存在时，取决于RNA聚合酶与启动子的相互作用或启动频率，若终产物（氨基酸）过量时，它作为辅阻遏物（corepressor）干扰转录的发动。

Trp、His等操纵子中存在弱化子，操纵子的表达与转录起始频率以及启动子的调节关系不大，而主要取决于弱化子的控制。RNA多聚酶要么在弱化子处停止最终脱落下来，要么向结构基因方向通过去。也就是当过量的终产物（氨基酸）存在时，使细胞内有过量的对应氨基酸的氨基酰tRNA产生，它能使已发动的转录终止在第一结构基因前。

B.协调一般认为野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物。若获得无活性阻遏物的突变细胞，Trp合成酶的浓度就比野生型细胞高出10倍以上。因此培养基中色氨酸浓度的变化就会影响这两种阻遏物的平衡，使之发生倾斜，最终发出关闭或启动Trp操纵子的命令，从而维持细胞内色氨酸的含量。

那么细菌中为什么还需要弱化子调控系统呢？其原因可能是：

a.阻遏物从有活性到无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统来维持适当氨基酸的水平。

b.弱化子系统主要是对外源氨基酸（色氨酸）浓度作出反应。

为什么还要阻遏体系呢？没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。当然His操纵子中，没有阻遏体系，只有弱化子调节。所以说明弱化子的调节作用是控制转录的终止，控制转录精细，是阻遏调控体系的次级调节。

三、分解代谢物阻遏（cataboliticrepression）调控

（一）分解代谢物阻遏的概念

所谓分解代谢物阻遏是指当细胞内具有一优先利用的营养物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，其分解产物对分解利用其它（难利用）营养物质所需的酶系合成起阻遏作用。

（二）分解代谢物阻遏的实质

分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了cAMP。(三)cAMP是对酶合成水平的控制（1）Lac.opern中的启动基因P包含两个位点：A，与CRP基因编码的一种调节蛋白，称cAMP受体蛋白简称CRP或CAP结合点。B，和RNA多聚酶结合的位点。(2)转录开始时，cAMP先与CAP或结合生成cAMP-CAP复合物。

(3)CAP-cAMP复合物再与Lac.opern中的启动基因P的CAP结合位点结合，从而激活了位点，进而促进RNA多聚酶与它的结合位点结合，使转录启动（注意CRP起正的作用），所以解除了分解代谢物的阻遏。（4）

RNA多聚酶进入RNA多聚酶位点向前漂移（5）当有诱导物存在时，RNA多聚酶进入操纵基因O位点内的转录起始点（6）cAMP在乳糖操纵子转录中是通过CAP-cAMP复合物与DNA结合时促进转录的，这种调控是正调控。

（7）细胞内cAMP水平在某些方向反映出细胞内能量的状态。

ATPcAMPAMPcAMP水平与腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的相对活性有关。

若CRP基因失活的突变株，就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因而只能在易被利用的基质上生长。若腺苷酸环化酶丧失的突变株，那么cAMP水平下降，那么就不能在受阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖）等上生长，但它和CRP缺陷突变株不同，外源加入cAMP还是有效的。(四)葡萄糖对细胞内cAMP水平的调节（1）可能是由于葡萄糖分解过程中的某些中间产物抑制了细胞内cAMP的形成。（2）可能是这种中间产物激活了cAMP的分解（五）分解代谢阻遏的分子机制（六）分解代谢物阻遏作用的克服1、生产培养基内不使用阻遏性碳源，将有利于对分解代谢物阻遏敏感酶的生产。

2、可利用一种不能代谢的诱导物的类似物，或缓慢补入诱导物或使用只能缓慢代谢的诱导物的衍生物来增加酶的生产。3、选育耐（