细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳课件

细胞凋亡的DNA琼脂糖

凝胶电泳细胞凋亡（apoptosis）细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义：①确保正常发育生长：清除多余的细胞②维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞③积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180~200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。实验原理本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成180-200bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNAladder)，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状”。材料1.凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞2.提取DNA：基因组DNA抽提试剂盒（RNA酶、蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNAladder标准品等）3.DNA电泳：1%的琼脂糖凝胶、点样缓冲液4.实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、65℃水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪方法一、胸腺细胞的制备：小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心5min，制成1×107细胞悬液备用。二、提取胸腺细胞DNA：⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。(2)结合DNA阶段(使用到的试剂:

结合缓冲液=B液、3MNaAC,pH4.8)加入10μl3MNaAC，随后加入1250μlB液，充分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置1分钟，离心30s。(3)漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液×2=W液）倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，12000rpm离心30秒。重复上叙步骤，再次加入600ulW液，12000rpm离心30秒。倒掉废液，再次12000rpm离心30秒。(4)洗脱收获（使用试剂：50μl洗脱缓冲液=T液）小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干净的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中间小心加入50μlT液，静置1分钟后，于12000rpm离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组DNA,取10μl电泳。三、DNA琼脂糖凝胶电泳：(5)制板:将1%的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒板,待凝,取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。(6)加样：取50uLDNA样品与10uL点样缓冲液,混匀,10ul/孔。（DNAmarker直接加样，5ul/孔）。(7)电泳：点样孔置负极，电压80-100V，电泳至溴酚兰移出2/3距离时，关闭电源。(8)观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿色DNA区带。注意事项：a步骤2中，加入B液后一定要充分混匀。离心后，小心取出上清，Tips头不可吸附上白色沉淀（为基因组蛋白）。b漂洗阶段（步骤3）一定要离心充分去除漂洗缓冲液，可适当将离心时间延长。c洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。结果观察加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型的“阶梯状”条带。未加地塞米松培养的胸腺细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡1：DNAmarker;2-3：细胞坏死对照4-6：细胞凋亡；7：正常细胞对照基因组DNA抽提试剂盒SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分离EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA不再降解Proteinas