大连近岸海域经济贝类麻痹性贝毒的检测与分析

大连近岸海域经济贝类麻痹性贝毒的检测与分析

大连是美国和山东的主要养鸡场。随着气候变暖及赤潮的频繁发生,大连地区出现贝毒危害,并且已经影响到本地区的贝类食用安全和贝类出口。因此加强大连近岸海域毒素的含量监测对于海产贝类的食用安全极为重要。对我国南方海域贝毒分布状况研究已有报道,如吴施卫等对广东沿海麻痹性贝毒的地理分布特征进行了研究,并对2003年的海南近岸海域的贝类中麻痹性贝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)进行了小白鼠检测分析。胡颢琰等采用小白鼠生物检测法和HPLC法对浙江舟山海域和浙江中南部海域的PSP进行了调查分析。目前对我国北方海域贝毒分布状况研究相对较少。随着沿海近岸水体污染日益严重,有必要对大连近岸海域的贝毒分布状况进行研究。研究不同器官中可溶性毒素结合蛋白对于阐明贝毒的积累机理尤为重要。PSP主要是由于贝类通过滤食或摄食能产生PSP的有毒藻类而积累的,其各组织积累PSP的能力存在明显的组织间差异。目前,针对虾夷扇贝中贝毒结合蛋白的研究没有报道。本文针对大连近岸海域的情况,研究了贝毒分布和虾夷扇贝不同组织中的蛋白质对麻痹性贝毒的结合能力,为贝毒的监测和和深入研究提供基础数据。1材料和方法1.1样品采集和采集样品于2007年1月至2008年10月间在大连地区的长海、庄河、瓦房店和旅顺近岸海域进行了样品采集,所采样品均为当地的养殖和食用贝类。同时,在大连市的黑石礁和长兴水产市场采集了样品。样品采集后,立即在现场对样品进行预处理。用干净的海水洗去样品外壳,用解剖刀将样品组织与贝壳分开,再将消化腺与其他组织分开,各部分称量后置入保鲜食品袋内,于-20冷冻保存。1.2小鼠单位毒素提取参照出口贝类麻痹性毒素检验方法SN0352-95和AOAC检测方法对PSP毒素用鼠单位予以定量。鼠单位定义:对体重为20g的小白鼠腹腔注射1mL贝肉提取液,在15min时杀死小鼠所需的最低毒素量为1鼠单位。采用Saxitoxin(PSP)毒素作为毒素的标准品,将鼠单位换算成毒素的微克数。根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间,并按小鼠体重,校正鼠单位,计算每100g贝肉内的麻痹性毒素的微克数。测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性毒素的总量。1.3酶标板的制备分别取100μLPBS、100μL样品加入100μL碳酸盐缓冲液置于96孔酶标板中,于4冰箱中孵育12h。把酶标板中的溶液倒掉,用PBS缓冲液洗3次(100μL/孔)。加入0.1%的BSA-PBS缓冲溶液(100μL/孔),将该板置于37的保温箱中恒温2h。取出酶标板,把酶标板中的溶液倒掉,用PBS缓冲液洗3次。每孔加入50μL酶联麻痹性贝毒,混匀,室温下避光放置15min。每孔加入100μL终止液,混匀,15min内用酶标仪测定OD450。1.4资金积累的检测取蛋白质粗提液加于DE52纤维素离子交换层析柱上,以含有0～1mol/LNaCl的0.05mol/LpH7.4PB进行梯度洗脱,然后用紫外分光光度计在280nm处测每试管洗脱液的吸光值,收集有吸收峰的洗脱液,采用Saxitoxin(PSP)ELISA试剂盒,测定贝毒结合蛋白结合麻痹性贝毒的能力,将具有贝毒结合能力的洗脱液合并,透析冻干。对DE52纤维素离子交换层析所得的有贝毒结合能力的组分进行SephadexG-100分子筛层析。层析柱2×100cm,以0.05mol/LpH7.4PB为洗脱液。用紫外分光光度计在280nm处测每试管洗脱液的吸光值,收集有吸收峰的洗脱液,采用ELISA方法测定有吸收峰的洗脱液的贝毒结合能力,将具有贝毒结合能力的洗脱液合并,透析冻干。1.5聚丙烯酰胺的合成根据Laemmli的方法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定贝毒结合蛋白。用15%聚丙烯酰胺作为分离胶,4%聚丙烯酰胺作为浓缩胶。分子量的测定是通过如下标准蛋白:磷酸化酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(42.7kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、胰蛋白酶抑制剂(20.14kDa)和α-乳清蛋白(14.4kDa)。2结果与讨论2.1pcr检测能力大连近岸海域PSP的检测结果列于表1。从表1可以看出2007年4月、5月、6月、7月和9月以及2008年4月、5月、7月和8月在长海哈仙岛、长海獐子岛、长海广鹿岛、长海财神岛及庄河黑岛的扇贝和虾夷扇贝中检测的PSP超标。2008年4月长海财神岛的虾夷扇贝PSP为1512Mu/100g软组织,超标3.78倍,2008年5月庄河黑岛的扇贝PSP为1134Mu/100g软组织,超标2.84倍。同时,2008年2月、4月瓦房店交流岛的魁蚶中PSP超标。2008年3月长海财神岛的紫石房蛤中以及2008年5月、6月长海獐子岛的紫石房蛤中PSP含量均超标。在杂色蛤和牡蛎中未检出PSP。从发生的时间上来看,2007年4月至9月及2008年2月至8月贝类中的PSP超标情况较多。对大连地区近岸海域麻痹性贝毒分布情况的调查,目前开展较少。本论文进行的研究工作,由于时间较短,其结果可能带有一定的偶然性,但一定程度上反映了目前大连地区近岸海域麻痹性贝毒分布情况的一些基本特征。大连长海县海域是重要的海水养殖区,由于养殖区内水体交换速度慢,分布集中,养殖密度过大,大量生物代谢物无法及时为底栖生物及微生物消耗和分解,从而造成沉积。长期的高密度养殖使海域极度富营养化,在此情况下,极易引发藻类的繁殖。因此,大连地区近岸海域麻痹性贝毒含量的高低与海域的富营养化密切相关。2.2虾夷贝毒结合细胞的分离和纯化选取经小白鼠生物检测法未检出PSP的虾夷扇贝,分别取贝肉、消化腺及裙边的蛋白质为样品,每种样品进行梯度稀释,用ELISA法测其结合PSP的能力。再用酶标仪测定OD450数据如表2所示。由表2可知:虾夷扇贝贝肉、消化腺、裙边中均能与PSP结合,且具有浓度依赖性,其中贝肉中蛋白质结合PSP的能力最强,因此选用贝肉蛋白质为样品进行分离贝毒结合蛋白。将虾夷扇贝贝肉中蛋白质的粗提液经DEAE-52柱层析,测定OD280,结果如图1所示,洗脱过程中收集到3个明显的峰。分别合并17-36管、38-49管、51-83管,透析、冷冻干燥以备用。并取第26管、41管、62管、67管作为样品,用ELISA法测定其结合PSP的能力。第67管中蛋白质与PSP结合的量最多,合并57-76管层析组分继续分离。经SephadexG-100柱层析,测定结果如图2。ELISA检测表明,第46管中蛋白质与PSP结合的量最多。合并第43-47管,冻干经SDS检测,初步分离的虾夷扇贝麻痹性贝毒结合蛋白的分子量为113kDa和72.4kDa(图3)。3虾夷小贝中的4种贝毒结合能力的比较大连地区近岸海域经济贝类麻痹性贝毒从发生的时间上来看,2