免疫学实验：NK细胞毒活性

·1·NK细胞毒检测·2·自然杀伤细胞（NK）介导天然免疫应答，它不依赖抗体和补体，即能直接杀伤靶细胞，如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞等；此外，尚有免疫调节功能，也参与移植排斥反应和某些自身免疫病的发生发展。NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。例如在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。

NK细胞活性检测·3·实验分组及材料实验原理检测方法主要操作步骤结果判定主要内容·4·器材75%酒精 若干5ml注射器1个/组100ml烧杯1个/组无菌纱网 1块/组无菌平皿 1块/组无菌吸头（大、中、小）3盒/room无菌96孔培养板 1块/组无菌离心筒1个/组可调微量加样器 1套/组细胞计数板1套/组显微镜 1台/组EP管 若干眼科剪、小镊子 1套/组细胞培养箱1台/room酶标仪1台离心机 2个/room超净台 1台/组动物、细胞及试剂小鼠 1只/组(NS,OVA)YAC-11*106*2ml

培养液（DMEM)无FCS 10ml/组培养液(DMEM)10%FCS10ml/组LDH底物 3ml/组柠檬酸（终止液）1ml/组分组：每组4人1只小鼠实验分组及材料·5·NK（naturalkiller）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。原理通过杀伤激活受体（KAR）直接识别通过抗体间接识别：ADCC分泌杀伤介质：perforingranzymeTNFIFN

清除异常细胞（肿瘤、病原体感染）

NK细胞功能：清除异常细胞通过杀伤激活受体（KAR）直接识别通过抗体间接识别：ADCC实验原理

NK细胞+靶细胞靶细胞破裂,释放内容物胞浆内酶类LDH酶活性胞浆内蛋白放射性铬酸钠51Cr标记DNA3H-TdR掺入·10·密度梯度离心Ficoll密度梯度离心Percoll密度梯度离心磁化细胞分离器分离法

NK细胞分离方法·11·同位素释放法：51Cr、3H-TdR、125I-UdR

乳酸脱氢酶释放法(本次实验采用)

常用的检测方法·12·G0G1SNa251CrO4、

3H-TdR、125I-UdR

NewDNAOrProteincpm同位素释放法·13·应用放射性同位素（如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)，即可计算出NK细胞毒活性。同位素释放法·14·乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。乳酸脱氢酶释放法-原理·15·靶细胞YAC-1NK杀伤LDH释放到细胞外无色底物LDH底物还原有色物质测OD570值乳酸脱氢酶释放法靶细胞膜损伤最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值

杀伤率(%)=Max-S自发实验值-自发释放值×100·16·操作流程1W无菌取脾研磨成单细胞悬液+2ml1640（无FBS)细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度1×107/ml5%CO237℃培养2小时离心，取100ul上清移入新孔，37℃孵育10min加入底物100ul/well室温避光孵育15min

30

l/孔1mol/L柠檬酸

酶标仪测吸光度值：OD570nm结果判定：培养YAC－1细胞＋10%FBS

1640培养液调细胞浓度1×106/ml·17·单细胞悬液的制备小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml1640培养液的平皿内。用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml离心管中，再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中，剩余3ml培养液备用。1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml1640培养液重悬细胞。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。调脾细胞浓度至1×108/ml，每组所需总量为1ml调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。实验步骤·18·细胞培养：按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%CO2培养箱中，培养2小时。LDH底物：在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。室温避光保存15min。

取出，加入1mol/L柠檬酸，30

l/孔。酶标仪读数前保证没有气泡。结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。结果判定：Max（靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值S自发

（靶细胞自发释放）=自发释放孔均值-培养基对照孔均值注：S自发＜0，做“0”处理实验步骤SI=Max-S自发实验孔值-自然释放孔值×100%·19·1-34-67-910-12A自然释放孔100ulYAC-1cells+100ul10%1640B(E:T=100:1）

100ulYAC-1cells+100ulspleenCellsC(E:T=50:1）100ulYAC-1cells+50ulspleenCells

+50ul10%1640D(E:T=25:1）100ulYAC-1cells+25ulspleenCells

+75ul10%1640E最大释放孔10ulYAC-1cells+90ul10%1640+100ul1%triton100F最大释放对照孔100ul1%triton100

+100ul10%1640G培养基对照孔200ul10%1640Max=E-F

S自发=A-G

加板方法Max-S自