不同治法中药药物血清对体外培养nf-致动脉内皮细胞结构的影响

不同治法中药药物血清对体外培养nf-致动脉内皮细胞结构的影响

血管内皮细胞（pvi）是一个高度分散的细胞。它是体中唯一一个与血液直接接触的细胞。它合成、代谢和分泌功能包括免疫、炎症和组织的恢复过程。在生理、病理过程中发挥着重要作用,参与保持内环境的稳定。VECs的损伤是多种疾病发生、发展的基础,部分中药可有效保护VECs,防治和减轻疾病发生发展过程中所造成的VECs损伤。在动脉粥样硬化(AS)形成的防治过程中,VECs的功能极其关键,探寻有效保护VECs的中药,有十分重要的临床意义。观察内皮细胞形态结构及生长的变化,是探讨药物对血管内皮细胞保护作用的方法之一。本实验通过体外实验观察了不同治法中药药物血清对TNF-α刺激下内皮细胞结构以及细胞增殖的影响。1材料和方法1.1材料表面1.1.1仪器、仪器和仪器1640培养基、EDTA牛胰蛋白酶、小牛血清、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(上海华美生物工程公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(SIGMA公司);超净工作台(上海净化设备厂);CO2培养箱(HERAEUSCO.B5060EK/CO2);低温离心机(上海手术器械厂;80-2型);倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂;XDS-1B);多功能酶标仪(芬兰Labsystem生产;DQ3022A型);流式细胞仪(BectonDickinsonFacscalibor)。1.1.2中药水生全粉组全方组:垂盆草、黄芩、昆布、海藻、生大黄、制首乌、丹参、蒲黄、甘草等;清法方组:垂盆草、生大黄、昆布;软坚方组:海藻、昆布、牡蛎;活血方组:丹参、蒲黄、生大黄;西药组:辛伐他汀片,20mg/片。以上中药饮片均由宁夏古方大药店提供,按传统煎煮方法制成中药水煎剂,减压浓缩为3g·mL-1(含生药量)。辛伐他汀片(广州南新制药有限公司),国药准字H20010750,产品批号:SST00205,用生理盐水配制成0.4mg·mL-1。1.1.3细胞al猪髋动脉内皮细胞(Arteryendothelialcells简称Aecs)(中国科学院上海细胞库)。用含50U·mL-1庆大霉素、15%灭活新生牛血清的1640培养液,在5%CO2和37℃充分湿化条件下培养备用。1.1.4实验动物选用16只Wistar雄性大鼠,清洁级,体重(200±20)g,由宁夏医科大学实验动物中心提供[scxk(宁)2011-0001]。1.2方法1.2.1各组大鼠等效剂量计算1)分组及给药方法:将大鼠16只随机分为8组(即正常对照组、TNF-α组、清法方组、对照组、软坚方组、活血组、全方组、辛伐他汀组),每组2只。按“实验动物与人的体表面积比”中人鼠等效药量换算方法计算给药剂量,清法方组16g·(kg·d)-1,全方组21g·(kg·d)-1,软坚组18g·(kg·d)-1,活血组16g·(kg·d)-1(均为生药量),辛伐他汀0.67mg·(kg·d)-1灌胃;对照组以等量生理盐水灌胃,1次·d-1,续灌3d后,当夜禁食不禁水,第4天再给药一次,各中药组在末次给药后1.5~2h,辛伐他汀组在给药后1h腹主动脉采血,将血液注入无菌试管,加盖。2)动物采血及分离血清:根据文献分离血清,-20℃保存备用。1.2.2tnf-s的制备1.2.3细胞移植1.2.4血清含药血清10d取对数生长期的猪髋Aecs,同上调成细胞悬液(0.5~1.5)×106·mL-1,接种于96孔培养板上,200μL/孔,37℃,5%CO2温育24h后,再用0.2%小牛血清的培养液静止24h,同化至G1期,然后随机分为8组。A组(正常对照组):0.2%培养液;B组(TNF-α组):0.2%培养液+TNF-α(10ng·mL-1);C组(清法组):同B组+清法方组含药血清(10%);D组(20%清法组):同B组+清法方组含药血清(20%);E组(全方组):同B组+全方组含药血清(10%);F组(软坚组):同B组+软坚方组含药血清(10%);G组(活血组):同B组+活血方组含药血清(10%);H组(西药组):同B组+辛伐他汀组血清(10%);加入占培养基终浓度10%的含药血清100μL,37℃,5%CO2温育24h,在常规条件下培养3~7d。待测。1.3观察指标和方法1.3.1细胞毒性检测1)镜检细胞样品制备:消化细胞,以培养液(10%小牛血清RPMI1640)悬浮,每瓶(5×106个细胞)接种到培养瓶(25cm2)内,培养24h后,以培养液(0.2%小牛血清的RPMI1640)静止24h,分为8组,1瓶细胞/组,分组及给药如上。继续培养24h后,消化细胞,离心收集,用固定液(2.5%戊二醛)固定细胞。2)细胞形态:光镜下观察。3)细胞超微结构:电镜下观察。1.3.2mtt法检测细胞增殖率1)MTT法检测样品制备:消化细胞(10%小牛血清RPMI1640培养液悬浮),在100μL培养液中以5×103/孔,接种到培养板孔(96孔)内,培养24h后,再静止24h,分为8组(8个复孔/组),分组、给药如上。2)MTT测定方法:方法参考文献比色:选择490nm波长,以酶联免疫检测仪测定各孔光密度值(OD值)。根据公式计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组OD均值/对照组OD均值×100%1.4单因素方差分析每组OD值以ue0af±s表示,SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,以卡方检验进行率的检验。P≤0.05为差异有统计学意义。2结果2.1关于aecs的形态2.1.1tnf-检测正常组细胞数量多,饱满,核圆,无固缩,TNF-α组细胞量少,干枯感,细胞核固缩。TNF-α加药物血清各组损伤较少,细胞数量较多,无干枯感,细胞生长活跃。见图1(封4)。2.1.2tnf-合药物血清中细胞超微结构的变化正常对照组体外培养的Aecs胞膜完整且连续,结构为双层,表面有微绒毛。核椭圆形或圆形,细胞核染色质均匀,无固缩。线粒体不大,内质网不扩张。以TNF-α处理后,细胞损伤明显,胞膜不完整,破损,不连续,表面微绒毛减少。核膜扩张,双层结构消失。核变形,体积缩小、消失。核染色不均匀,线粒体肿大,胞浆内多见大小不等的空泡形成。TNF-α合药物血清共同处理的内皮细胞,其损害较单纯TNF-α处理的细胞小,细胞膜较连续,完整,切痕也较少,核变形较轻,线粒体肿大不明显。空泡形成减少。尤其是在TNF-α损伤实验同时加入药物血清的清法组、软坚组、西药组,细胞超微结构与正常对照组细胞没有明显差异。见图2(封4)。2.2各组细胞增殖情况从MTT实验结果来看,用TNF-α处理过后,体外培养的内皮细胞的增殖明显受到抑制,差异有统计学意义(P<0.01),经过与药物血清共同孵育后,可见各加药物血清组,细胞增殖率均明显上升(P<0.01)。其中以清法组、软坚组、全方组最明显。结果见表1。3防止血管内皮细胞损伤在各种刺激因素的长期作用下,VEC处于应激状态,对正常状态所固有的功能产生放大作用,甚至产生生理状态下所不具备的新功能,主要表现为增强生物活性蛋白的合成。这一过程为“内皮活化”,在细胞介导免疫反应的宿主防御中起到重要作用,但也能导致疾病。结合内皮活化的概念,可知AS病变始于内膜损伤,其过程是损伤在先,痰凝血瘀在后,所以防止内皮细胞损伤是防治ASO的第一步。我们通过体内实验观察了不同治法中药对血管内皮细胞的保护作用,本文采用了血清药理学方法进行相应的体外实验研究。本次体外实验中,我们首先观察了TNF-α损伤实验中不同治法中药含药血清对内皮细胞光镜形态、超微结构以及生长的影响,发现用TNF-α处理后,细胞损伤明显;而清法方药物血清组的Aecs超微结构与正常对照组细胞差异不明显,说明清法方含药血清能减轻TNF-α对内皮细胞的损伤,保护内皮细胞的完整性。MTT实验结果显示,用TNF-α处理过后,体外培养的内皮细胞的增殖明显受到抑制,经过与药物血