纳米载体的制备及其对RAW264.7和U251细胞的影响研究

前言人们在近几十年中，对癌症的基础研究有了很大进展，发现了很多有效的抗癌聚合物。但是研究成果中的很大一部分都还是停留在实验室研究，并没有实际运用到临床。造成这种情况的主要原因之一是没有让这些药物抵达指定目的地的方法，而与此同时不会或者尽量少的发生对机体组织的破坏。但到目前为止，常规的静脉注射给药是没有办法做到的。例如，有文献统计，把单克隆抗体注射到静脉中，一般只有万分之一到达期望值[1,2]。这不但使得治病花费大，药物浪费，还达不到想要的治病目的。科学家们为了找到能够增强药效靶向的有效方法投入了很多人力、物力以及财力，可见该研究课题具有很重要的研究意义[3-5]。研究者想要得到一种可以有效的避开机体阻碍，能把药物精准的运输到靶向部位的这样一种载体。但是，探索出一种行之有效的药物载体是极具挑战性的，这需要很多学科之间的相互配合。纳米颗粒具有不易沉淀，流动性和稳定性好等优点，因此世界上的许多研究者都想使用纳米技术靶向治疗一些不可治愈或是治疗方法副作用大的疾病。之前有文献报道使用柔性纳米脂质体治疗乳房癌，正是通过使用注射靶向给药的方法[6]。不同给药方式，药物运输方式也不同，而微粒靶向给药的传输方式主要是血液循环运送药物去指定部位。微颗粒在血管中的运动范围一般在血管壁附近的几微米之内，这样的目的就是为了躲开血管中心的红细胞[7]。当微颗粒靶向给药时，血液循环运送药物到指定部位，微颗粒表面的配体和靶向部位的受体之间产生的吸引力使其二者相互粘附，使微颗粒产生内化作用，将药物释放于靶向部位，从而起到给药治病的作用。本论文制备了不同粒径大小和不同形状的纳米载体（脂质体、类脂囊泡与碳纳米管）。将CpGODN包裹在其内部或吸附在其表面，并在细胞摄粒作用下将CpGODN分别引入免疫细胞与癌细胞，从而实现细胞给药。探索其粒径和形状对免疫细胞激活的影响，及对癌细胞的杀伤作用。寻找相对合适的粒径和形状，从而为纳米材料在医药领域的应用提供理论基础。本研究以脂质体和类脂囊泡为载体，对新型雄激素受体抑制剂二甲基姜黄素制剂研究。将不溶于水且稳定性差的二甲基姜黄素包裹在脂质体和类脂囊泡中，考察了影响囊泡形成和包封率的处方和制备工艺条件，并对其进行了质量评价研究，为制备更稳定的二甲基姜黄素脂质体和二甲基姜黄素类脂囊泡制剂研究提供参考。西安交通大学网络教育学院毕业论文2不同粒径大小和不同形状的药物载体的制备2.1实验仪器实验操作用到的仪器见下表2-1。表2-1实验仪器一览表Tab2-1TheListofexperimentalinstruments仪器型号生产厂家旋转蒸发器R205B上海申生科技有限公司超声波清洗器PS-30AL深圳市深华泰超声洗净设备有限公司超声波细胞粉碎机ESW-650N上海茸研仪器有限公司纳米激光粒度仪NanoZS90英国马尔文有限公司高分辨透射显微镜JEM-2100日本电子株式会社旋片式真空泵2XZ-2浙江台州求精真空泵有限公司玻璃真空干燥器A-213北京鑫润科诺仪器仪表有限公司电子天平JA1203上海良平仪器仪表有限公司循环水式多用真空泵SHZ-D3河南省予华仪器有限公司恒温振荡器IS-RSD3上海沪粤明科学仪器有限公司脂质体挤出器Mini-extruder美国AvantiPolarLipids2.2实验试剂实验试剂见下表2-2。表2-2实验试剂一览表Tab2-2TheListofexperimentalreagents药品（试剂）名称规格生产厂家DOTAPD6182-250mgSigma-Aldrich胆固醇C0318-25g同上司盘60国药集团化学试剂有限公司三氯甲烷分析纯同上无水乙醇分析纯同上无水葡萄糖分析纯天津市北辰方正试剂厂超纯水机DW100-L上海和泰仪器有限公司磷酸盐缓冲溶液pH7.2-7.4北京诺博莱德科技有限公司CpGODN5`-TCGACGTTTTGACGTTTTGACGTTTT-3`苏州泓迅生物科技有限公司碳纳米管HipcoPurifiedBatchP1-0011.0gpowderNanoIntegri2.3不同粒径大小和不同形状的的药物载体的制备及表征2.3.1CpGODN/脂质体复合体的制备2.3.1.1四种方法制备不同粒径大小的脂质体为了制备不同粒径大小的CpGODN/脂质体复合体，最开始本文尝试了四种制备方法：薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法及乙醇注入法。薄膜分散法：用电子天平称取0.0023g卵磷脂放入烧杯1，胆固醇0.0027g放入烧杯2，在烧杯1和2中分别加入适量氯仿溶解，混匀烧杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒温加热，使用旋转蒸发仪除去溶剂。然后放入真空干燥器内干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，超声5min，然后将脂质体5%葡萄糖溶液倒入15mL离心管。接着用探头超声18min，每分钟超声30s，停30s，即得脂质体。逆相蒸发法：用电子天平称取0.0614g卵磷脂放入烧杯1，胆固醇0.0208g放入烧杯2，在烧杯1和2中分别加入适量氯仿溶解，混匀烧杯1和2中的溶液，倒入50mL离心管，用探头超声3min，每超声5s，停3s，倒入离心瓶，使用旋转蒸发仪除去溶剂。真空，过夜，37℃摇床30min，加适量5%葡萄糖溶液，超声10min，即得脂质体。冷冻干燥法：用电子天平称取0.0023g卵磷脂放入烧杯1，胆固醇0.0027g放入烧杯2，在烧杯1和2中分别加入适量氯仿溶解，混匀烧杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒温加热，使用旋转蒸发仪除去溶剂。然后放入真空干燥器内干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，手摇10min，超声10min，然后将脂质体5%葡萄糖溶液倒入15mL离心管。将离心管放入-80℃冰箱10min，取出放入真空冷冻干燥箱48h。48h后，将离心管取出加入适量5%葡萄糖溶液，即得脂质体。乙醇注入法：用电子天平称取0.0023g卵磷脂，胆固醇0.0041g放入烧杯1，加入适量无水乙醇，搅拌使溶。打开水浴锅，调到65℃，在烧杯2中加入80mL5%葡萄糖溶液，将其放入水浴锅中。当烧杯2中的温度达到65℃时，将烧杯1中的溶液通过注射器匀速注入烧杯2中，缓慢搅拌10min，水浴保温半小时。冷却后取出，滤膜过滤，即得脂质体。2.3.1.2薄膜分散法制备不同粒径大小的脂质体使用薄膜分散法制备脂质体。本文考察了两种磷脂（卵磷脂和DOTAP）与胆固醇作为成膜材料，且改变卵磷脂/DOTAP与胆固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、2：1、3：1、4：1）来制备脂质体。用电子天平称取适量卵磷脂/DOTAP放入烧杯1，胆固醇放入烧杯2，在烧杯1和2中分别加入适量氯仿溶解，混匀烧杯1和2中的溶液，倒入梨形瓶，37℃恒温加热，使用旋转蒸发仪除去溶剂。然后放入真空干燥器内干燥24h。24h后，梨形瓶中加5%葡萄糖溶液10mL，超声5min，然后将脂质体5%葡萄糖溶液倒入15mL离心管。接着用探头超声18min，每分钟超声30s，停30s，即得脂质体。将之前制备好的脂质体与5%葡萄糖溶液溶解的CpGODN以7.5:1(摩尔比)的比例混合，并在37℃下放置30min形成CpGODN/脂质体复合体。脂质体挤出器过滤CpGODN/脂质体溶液，纳米激光粒度及Zeta电位分析仪25℃测定脂质体粒径及Zeta电位。并使用TEM观察CpGODN/脂质体复合体的形态。2.3.2CpGODN/类脂囊泡的制备采用薄膜分散法制备CpGODN/类脂囊泡。本文考察了三种非离子表面活性剂（Span40、Span60和Span80）与胆固醇作为成膜材料，改变非离子表面活性剂与胆固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、2：1、3：1、4：1）制备类脂囊泡。首先，称取适量非离子表面活性剂（Span40、Span60和Span80）和胆固醇于圆底烧瓶中。再向其中加入2mL有机溶剂混合物（三氯甲烷：乙醇=4:1，v/v）溶解，于50℃减压蒸发至均匀成膜（转速为65r/min），用铝箔纸封住瓶口真空干燥4h以上。真空干燥结束后，向烧瓶中加入PBS10mL，控温于50℃并置水浴超声仪中超声30min形成混悬液，再在冰水浴条件下，650W、20-25KHz探头超声10min（工作9.9s，间歇9.9s）使之分散均匀，即得类脂囊泡。置4℃冰箱保存备用。将制备好的类脂囊泡与CpGODN以类脂囊泡与CpGODN为7.5:1的比例混合，并在37℃下放置30min形成CpGODN/类脂囊泡复合体。与CpGODN/脂质体复合体的表征方式相同，过滤，测粒径及Zeta电位，再在TEM下观察CpGODN/类脂囊泡复合体的形态。2.3.3CpGODN/碳纳米管的制备已有文献报道，CpGODN之间是通过π-π共价键结合的螺旋状双链DNA。截短纯化过的单壁碳纳米管可以通过在CpGDNA的存在下，超声处理后有效地分散在水中。CpGDNA可通过π堆叠结合碳纳米管，产生螺旋形缠绕到表面。CpGDNA和碳纳米管结合自由，可以使两个碳纳米管相分离。将CpGODN与碳纳米管混合后，碳纳米管可以通过共价键与CpGODN结合，CpGODN缠绕在碳纳米管上，从而使碳纳米管能均匀地分散在溶液中。本文尝试把CNT分别溶解在5%葡萄糖溶液、1%十二烷基硫酸钠溶液与CpGODN（碳纳米管：CpGODN=1.0：0.1、碳纳米管：CpGODN=1.0：0.5、碳纳米管：CpGODN=1.0：1.0）中，观察了碳纳米管在其中的分散性。2.3.4电镜表征方法采用负染法对制备好的脂质体、类脂囊泡与碳纳米管的形态进行表征。方法如下：用镊子夹住铜网边缘，将待测样品用滴管或者注射器滴在铜网上，静置1min。用普通滤纸将多余的样品从另一边吸走，待上层膜干，用一次性滴管滴加1滴磷钨酸（浓度1%-3%）至铜网上，静置1min，滤纸吸走多余的样品。如果颜色太深，需加1滴水将染料稀释。等待几秒，滤纸吸走，自然晾干，待测。2.3.5实验结果2.3.5.1脂质体粒径与形态的表征四种方法制备的脂质体粒径结果如下：表2-3脂质体粒径及Zeta电位Tab2-3ParticlesizeandZetapotentialofliposomes方法粒径（nm）Zeta电位（mV）薄膜分散法118.5-38.2逆相蒸发法802-36冷冻干燥法1460-23.5乙醇注入法105.5-21.4如表2-3结果所示，使用薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法及乙醇注入法这四种方法制备的脂质体虽然可以制备出不同粒径大小的脂质体，但是粒径之间没有规律性的梯度，制备的脂质体粒径过大，没有进一步讨论的意义。而且，脂质体由于是不同方法制备的，方法之间存在差异性，没有可比性，因此本文不采用这四种方法制备的脂质体。本实验的目的是得到不同粒径大小的脂质体，本文尝试从制备脂质体的材料方面入手，改变卵磷脂/DOTAP与胆固醇两种材料的比例来检测所制备的脂质体的粒径大小与Zeta电位。结果如下：表2-4脂质体粒径及Zeta电位Tab2-4ParticlesizeandZetapotentialofliposomes卵磷脂:胆固醇粒径（nm）Zeta电位（mV）1：1155.6-38.31：2215.4-31.91：3171.4-27.61：4156.9-32.51：5151.2-322：1142.1-34.83：1127.6-39.44：1123.4-43.1从表2-4的结果得出，通过不同比例的卵磷脂和胆固醇制备的脂质体虽然粒径小，但都基本处于100-200nm，粒径比较集中，粒径之间没有明显的差异性，且没有可比较的粒径梯度，因此不能进行粒径大小的比较。此外，由于卵磷脂带负电，制备的脂质体也带负电。表2-5脂质体粒径及Zeta电位Tab2-5ParticlesizeandZetapotentialofliposomesDOTAP:胆固醇粒径（nm）Zeta电位（mV）1：1105.852.11：2109.243.71：3134.055.41：4256.652.31：5600.553.22：1116.6453：1160.442.84：1144.242.7从表2-5的结果得出，与卵磷脂和胆固醇制备的脂质体相比，通过不同比例的DOTAP和胆固醇制备的脂质体粒径均匀，且粒径之间差异比较明显，具有梯度性，因此可以进行粒径大小的比较。此外，由于DOTAP带正电，制备的脂质体也带正电。而且与卵磷脂和胆固醇制备的脂质体相比，DOTAP和胆固醇制备的脂质体的Zeta电位比较大，表示其分散度较好。本文采用了图2-1所示的三种粒径差异比较明显，且具有粒径梯度的粒径（105nm、256nm及600nm）来进行纳米载体粒径大小的比较。图2-1脂质体粒径及Zeta电位Fig2-1ParticlesizeandZetapotentialofliposomes(n=3)图2-2脂质体透射电镜图Fig2-2TEMmicrographofliposomes如图2-2电镜图所示，制备好的脂质体粒度大小均匀，表面光滑，多为圆形，无覆盖和粘连现象。实验结果表明：使用薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、乙醇注入法这四种方法制备的脂质体与由卵磷脂和胆固醇制备的脂质体不符合实验要求。从表2-5及图2-1的结果看出，通过不同比例的DOTAP和胆固醇分别制备了三种不同粒径梯度的脂质体。当DOTAP和胆固醇的比例为1:1,1:4和1:5时，脂质体平均粒径分别为(105±3.4)nm,(256±4.1)nm和(600±5.7)nm。Zeta电位是粒子间的引力和斥力的度量，是分散度的指标。Zeta电位绝对值越大，分散越好。与粒度相似，了解Zeta电位有助于预测其在人体内的变化。Zeta电位实验结果表明，这3种粒径大小的脂质体所对应的Zeta电位之间的差异不大，但数值不低，表明其分散性良好。卵磷脂为阴离子磷脂，其制备的脂质体带负电，与DNA之间具有排斥作用。而DOTAP阳离子磷脂制备的脂质体带正电，这使得其二者可以很好的结合。而且，阳离子脂质体比中性和阴离子脂质体有更高的免疫效应。2.3.5.2类脂囊泡粒径与形态的表征三种非离子表面活性剂作为成膜材料的实验结果如图2-3所示：图2-3非离子表面活性剂的包封率Fig2-3EffectofNonionicsurfactantsontheencapsulationefficiency(n=3)图2-3测定CpGODN/类脂囊泡包封率的结果表明，Span40、Span60和Span80作为成膜材料与胆固醇制备的类脂囊泡测定的包封率分别为(61.8±5)%、(86.1±11)%和(49.5±9)%（n=3）。司盘-60作为囊泡材料制备的类脂囊泡包封率高，且外观呈均一的混悬液。原因可能是包封率受囊材结构的影响。司盘-40和司盘-60的烷基链长度不同，其中司盘-60的烷基链长。而司盘-80结构中具有不饱和双键，邻近分子排列不紧密，药物易泄露。而且司盘-60相变温度最高，包封率最高。通过实验优化，选择非离子表面活性剂司盘-60作为类脂囊泡的囊泡材料。本研究采用Span60和胆固醇两种囊材的不同比例制备类脂囊泡，对类脂囊泡的粒径及Zeta电位进行调控。结果如下：表2-6类脂囊泡粒径及Zeta电位Tab2-6ParticlesizeandZetapotentialofniosomesSpan60:胆固醇粒径（nm）Zeta电位（mV）4:1301.4-29.43:1282.6-32.82:1116.4-37.51:1127.4-38.31:2298.8-30.21:3762.2-30.71:4800.2-31.8从表2-6的结果得出，通过不同比例的Span60和胆固醇制备的类脂囊泡粒径均匀，且粒径之间差异也比较明显，也有明显的粒径梯度，因此可以进行粒径大小的比较。而且制备的类脂囊泡的Zeta电位较大，表明其分散度较好。本文采用了图2-4所示的三种粒径差异比较明显，且具有粒径梯度的粒径（127nm、298nm及800nm）来进行粒径大小的比较。图2-4类脂囊泡粒径及Zeta电位Fig2-4ParticlesizeandZetapotentialofniosomes(n=3)图2-5类脂囊泡透射电镜图Fig2-5TEMmicrographofniosomes如图2-5电镜图所示，制备好的脂质体粒度大小均匀，表面光滑，多为圆形，且无覆盖和粘连现象。实验结果表明：由于Span40和Span80的包封率低，因此，本文采用Span60作为成膜材料。如表2-6及图2-4所示，Span60和胆固醇以不同比例分别制备了三种不同粒径梯度的类脂囊泡。当Span60和胆固醇的比例为1:1、1:2和1:4时，类脂囊泡的平均粒径分别为（127±2.9）nm,（298±3.6）nm和（800±4.4）nm。这3种粒径大小的类脂囊泡的Zeta电位的差异不大。制备类脂囊泡时，超声虽然可以改变类脂囊泡的粒径大小，也可使大多室类脂囊泡转变为小单室类脂囊泡，但如果超声时间过长会使类脂囊泡的稳定性变差，根据文献本次实验选定时间为10min。2.3.5.3碳纳米管形态的表征将CNT分散在5%葡萄糖溶液、1%十二烷基硫酸钠溶液与CpGODN（碳纳米管：CpGODN=1.0：0.1、碳纳米管：CpGODN=1.0：0.5、碳纳米管：CpGODN=1.0：1.0）在离心时间为3min，超声时间为5-10min的条件处理后，实验结果如下图（图2-6至图2-10）所示：图2-6碳纳米管与5%葡萄糖混合A：混合超声效果图；B：经过10000r/min离心3min的效果图图2-6实验结果表明，图A中碳纳米管与5%葡萄糖溶液混合，在冰水浴超声30min后，碳纳米管在底部沉淀，没有均匀地分散在5%葡萄糖溶液中；图B中碳纳米管与5%葡萄糖溶液10000r/min离心后，碳纳米管几乎全部沉在离心管底部。表明，碳纳米管在5%葡萄糖溶液中的分散效果差。图2-7碳纳米管与1%十二烷基硫酸钠溶液混合A：混合超声效果图；B：经过10000r/min离心3min的效果图图2-7实验结果表明，图A中碳纳米管与1%十二烷基硫酸钠溶液混合，在冰水浴超声30min后，碳纳米管可以均匀地分散在1%十二烷基硫酸钠溶液中；图B与5%葡萄糖溶液相似，碳纳米管与1%十二烷基硫酸钠溶液10000r/min离心后，碳纳米管几乎全部沉在离心管底部。表明，碳纳米管在1%十二烷基硫酸钠溶液中的分散效果差。而且，十二烷基硫酸钠对人体有毒性，不适用于人体。图2-8碳纳米管：CpGODN=1.0：0.1效果图A：碳纳米管：CpGODN=1.0：0.1混合超声效果图B：碳纳米管：CpGODN=1.0：0.1经过10000r/min离心3min的效果图图2-8实验结果表明，图A中碳纳米管与CpGODN以1.0:0.1的比例混合，在冰水浴超声30min后，碳纳米管均匀地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中；图B中碳纳米管与CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min离心后，大部分碳纳米管沉在离心管底部。表明，碳纳米管与CpGODN以1.0:0.1的比例在CpGODN中的分散效果差。图2-9碳纳米管：CpGODN=1.0：0.5效果图A：碳纳米管：CpGODN=1.0：0.5混合超声效果图B：碳纳米管：CpGODN=1.0：0.5经过10000r/min离心3min的效果图图2-9实验结果表明，图A中碳纳米管与CpGODN以1.0:0.5的比例混合，在冰水浴超声30min后，碳纳米管没有均匀地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中，离心管中间有絮状沉淀；图B中碳纳米管与CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min离心后，大部分碳纳米管沉在离心管底部。表明，碳纳米管与CpGODN以1.0:0.5的比例在CpGODN中的分散效果差。图2-10碳纳米管：CpGODN=1.0：1.0效果图A：碳纳米管：CpGODN=1.0：1.0混合超声效果图B：碳纳米管：CpGODN=1.0：1.0经过10000r/min离心3min的效果图图2-10实验结果表明，图A中碳纳米管与CpGODN以1.0:1.0的比例混合，在冰水浴超声30min后，碳纳米管均匀地分散在CpGODN的5%葡萄糖溶液中；图B中碳纳米管与CpGODN的5%葡萄糖溶液10000r/min离心后，碳纳米管仍分散的很均匀。表明，碳纳米管与CpGODN以1.0:1.0的比例在CpGODN中的分散效果好。上述实验结果表明，碳纳米管和CpGODN的比值为1.0：1.0时，碳纳米管分散性较好。从离心效果图来看，经过10000r/min离心3min后，离心管底部基本没有碳纳米管聚集，分散效果好。这可能是因为CpGODN的结构是π-π共价键结合的螺旋状双链DNA，碳纳米管具有独特的管状结构，CpGODN通过共价键与碳纳米管结合，缠绕在碳纳米管的表面。CpGODN与碳纳米管混合后，碳纳米管可以通过共价键与CpGODN结合，CpGODN缠绕在碳纳米管上，从而使碳纳米管能分散在溶液中。本文使用这个比例来考察CpGODN/碳纳米管复合体对细胞的作用。将1mgCNT与5mgCpGODN混合后，加入5mL5％葡萄糖溶液，冰水浴超声处理20min，形成CpGODN/碳纳米管复合物，TEM观察CpGODN/碳纳米管复合物的形态，并置于4℃冰箱保存备用。图2-11碳纳米管的透射电镜图Fig2-11TEMmicrographofCNT图2-11实验结果表明：透射电镜下观察CNT呈单根分布，很少有CNT重叠在一起。从电镜图中本文看到，CNT并不是全都笔直，而是都有一定程度或是弧度的弯曲。这可能是因为CNT在编织的时候不但有六边形，而且还出现了五边形与七边形，而正是这几种多边形之间相连的张力让CNT弯曲。西安交通大学网络教育学院毕业论文3不同粒径大小与不同形状的药物载体对细胞的影响3.1实验细胞系细胞名称：RAW264.7来源：小鼠腹腔巨噬细胞细胞系细胞种类：巨噬细胞细胞类型：贴壁细胞培养基种类：RPMIMedium1640＋10%胎牛血清＋双抗培养的天数：2天;细胞倍增时间1-2天左右；细胞增殖至80%左右即可传代细胞状态与特征简述：细胞比较小，传代后，在第一天是圆形的，长了一段时间后，由于密度比较大会变成梭型，有触角；生长速度较快。图3-1RAW264.7细胞系Fig3-1RAW264.7cells细胞名称：U251来源：人神经胶质细胞瘤细胞细胞种类：肿瘤细胞细胞类型：贴壁细胞培养基种类：DMEM＋10%胎牛血清＋双抗培养的天数：1-4天；细胞倍增时间3-4天左右；细胞增殖至80%左右即可传代细胞状态与特征简述：刚解冻的细胞活力较弱，培养过一段时间后，繁殖增快。培养初始阶段，细胞呈圆形，之后在分裂期可能就会变为多角状。图3-2U251细胞系Fig3-2U251cells3.2实验仪器实验操作时用到的仪器见下表3-1。表3-1实验仪器一览表Tab3-1TheListofexperimentalinstruments仪器型号生产厂家超净工作台SJ-CJ-2D苏州苏洁净化设备公司CO2培养箱311ThermoFisherScientific倒置相差显微镜TS100-FNikon冰箱BCD-630WDA合肥荣事达三洋电器股份有限公司离心机ST8ThermoFisherScientific酶联反应检测仪ELX800UVBioTek高压蒸汽灭菌锅MLS-3750SANYO细胞培养瓶25m2Corning细胞培养板96孔板Corning离心管15mL,50mLCorning手动多道移液器10µL,,300µL,1000µLGenexBeta超纯水仪H20pro-UV-TSartoriousstedim鼓风干燥箱DHG-9035A上海鳌珍仪器制造有限公司3.3实验试剂实验试剂见下表3-2。表3-2实验试剂一览表Tab3-2TheListofexperimentalreagents试剂规格生产厂家RPMIMedium1640500mL上海立菲生物技术有限公司DMEM培养基500mL同上IronFortifiedBovineSerum500mLSclenCell 氯化钾（KCl）分析纯国药集团化学试剂有限公司氯化钠（NaCl）分析纯同上无水乙醇分析纯同上PBS磷酸盐缓冲液0.01MpH7.2-7.4NobleRyder青霉素-链霉素溶液100mL普诺赛TrypanBlue5gBiosharp胰蛋白酶5gGibcoDMSO100mLSigmaLifeScience小鼠TNF-α定量分析酶联免疫检测试剂盒(ELISA)小鼠TNF-α安徽巧伊生物科技有限公司CellCountingKit-8试剂盒CK04DojindoLaboratories3.4主要溶液的配制（1）青霉素-链霉素溶液的配制分别称取青霉素0.01g，链霉素0.01g，再分别溶于100mL超纯水（DDW）中，使浓度为100µg/mL。混合二者之后，搅拌使之均匀。滤膜过滤后，放在-20℃冰箱储存备用。（2）磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制分别称取氯化钠（NaCl）80g，十二水磷酸氢二钠（NaHPO4·12H2O）36.3g，氯化钾（KCl）2.0g与磷酸二氢钾（KH2PO4）2.4g，加入800mL超纯水溶解，将pH调至7.4，再用DDW定容至1000mL。实验用的PBS需将浓度稀释至1×PBS，121℃高温灭菌1h，4℃保存，待用。（3）0.25%胰蛋白酶溶液的配制用400mLPBS溶解1g胰蛋白酶与0.08gEDTA，放冰箱4℃保存过夜。调节胰蛋白酶溶液的pH为7.4。滤膜过滤，放入-20℃冰箱储存备用。（4）冻存液的配制RPMIMedium1640/DMEM培养基:胎牛血清:DMSO=8:1:1，现配现用。（5）75%乙醇溶液的配制将750mL的无水乙醇与250mL的超纯水混合均匀，即得。（6）4%台盼蓝溶液的配制在研钵中加入4g台盼蓝，再加入适量蒸馏水，研磨至无颗粒方止。再加100mL双蒸水，过滤，4℃冰箱保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。机理：因为正常活细胞的细胞膜是完好无损的，外来物质台盼蓝进入细胞后，使得细胞失活或是细胞膜变得不完整，通透性增加，台盼蓝将细胞染成蓝色。一旦细胞膜失去其完整性，细胞就是死亡状态。所以与别的方法相比，台盼蓝溶液作为区分细胞存活情况的方法具有简单、方便以及快速等优点。（7）培养基的配制RAW264.7细胞培养基的配制：RPMIMedium1640培养基一瓶500mL，加入50mL胎牛血清，及5mL双抗；U251细胞培养基的配制：DMEM培养基一瓶500mL，加入胎牛血清50mL，双抗5mL。3.5实验方法3.5.1免疫细胞及癌细胞的传代、冻存与复苏3.5.1.1免疫细胞RAW264.7传代将一个烧杯放入洁净操作台作为废液收集器，紫外灭菌30min，冰箱中取出灭菌过的PBS、含FBS的RPMIMedium1640培养基和胰蛋白酶，放入37℃水浴加热。细胞培养一段时间后，从细胞培养箱中取出，倒去培养液，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS）10mL，上下左右轻轻晃动洗去死细胞，倒掉PBS。加入1mL胰蛋白酶，轻拍瓶壁底部，待胰蛋白酶消化下细胞，加入10mLRPMIMedium1640培养基，反复吹打几次细胞，待细胞完全脱落为止。将细胞混悬液倒入15mL离心管，设置为1000r/min离心3min，倒掉上层培养基。再加入适量RPMIMedium1640培养基，用移液枪反复吹打混匀细胞。将20µLRAW264.7细胞悬液与60µL台盼蓝溶液混合，用移液枪转移到细胞计数板上，计细胞数目。要使稀释后的细胞悬液的最终浓度为1×106个/mL，用移液枪吸取1mL移至新的培养瓶中。用RPMIMedium1640培养基稀释10倍，使细胞浓度为1×105个/mL。不能以画圆的方式，应以上下左右的方式混匀细胞。最后，放入培养箱中培养。3.5.1.2癌细胞U251传代首先，在37℃恒温水浴锅中预热胰酶、DMEM培养基和经过高温灭菌的PBS。从培养箱中取出U251细胞培养瓶，倒掉其上层培养基。用10mL移液管吸取PBS至细胞培养瓶中，上下左右晃动，洗掉死细胞，弃去PBS。移取胰蛋白酶1mL至细胞培养瓶中消化2min。再吸取DMEM培养基10mL至细胞培养瓶中，洗吹几次使细胞从瓶壁上脱落下来，将洗下来的细胞悬液倒入15mL离心管。放入离心机，设置为1000r/min离心3min。离心结束后，倒掉离心管内上层的培养基。在离心管中加入适量DMEM培养基，混合均匀。用移液枪吸取1mL移至新的培养瓶中。使新的培养瓶中最终传代的浓度为1×105个/mL。放入培养箱培养。3.5.1.3细胞冻存第一步，先观察细胞是否处于可以被冻存的状态；接着，倒掉培养瓶中的培养基，用10mL灭菌过的PBS洗去死细胞及残留的培养基。加入胰蛋白酶，轻轻拍培养瓶底部，使得胰酶更易让细胞脱落。加入适量含有胎牛血清的培养基（RPMIMedium1640或者DMEM），吸吹几次，让细胞尽可能多的脱落。用移液管将细胞悬液移到离心管中，设置为1000r/min离心3min。倒掉上清液，加入适量培养基使其细胞浓度为1×105-1×106个/mL；最后，制备冻存液(要求现配现用)：将20%的

DMSO

1

mL（冻干保护剂）和RPMIMedium1640培养基（DMEM培养基）以8:2的比例混匀待用。将细胞浓度控制在1×105-1×106个/mL中，在无菌冻存瓶中加入一半细胞悬液及一半冻存液（总共1mL），用移液枪来回吸吹几次混匀，让细胞出于悬浮的状态，封口。瓶口朝上，写下细胞的种类及日期，-80℃冰箱或是液氮中冻存。3.5.1.4细胞复苏复苏细胞使用的方法是快速溶解法：在37℃恒温水浴锅中不停地晃动冻存细胞，最好在1min内快速融化。使用1000μL移液枪吸出细胞冻存液至离心管，吸取适量培养基至冻存管中，将残留在冻存管中的细胞洗净加入到离心管中，设置为1000r/min离心3min。倒掉上清液，加入适量培养基，混匀。用移液管将细胞悬液移至新的无菌细胞培养瓶中，加入培养基至10mL。将细胞培养瓶上下左右轻轻摇晃，放入培养箱培养。3.5.1.5细胞计数在洗净的细胞计数板上放上干净的盖玻片，吸取少量经台盼蓝染色的细胞混悬液。将细胞悬液注入细胞计数板上，要注意的是，这个注入的过程不能产生气泡，如果已有气泡产生，必须重新再做一次。整个细胞计数板有四大格，而其中每一大格又有四小格，共有十六小格，数完细胞后，使用公式计算细胞个数。细胞密度公式如下：细胞个数/mL=（数的细胞数×4×104）/4（1）图3-3细胞计数板示意图Fig3-3Schematicdiagramofcellcountingplate注：图3-3中表示可以计数；表示不可计数；左图为细胞计数板的结构，右图为左图中圆圈内的部分。3.5.2检测不同粒径大小及不同形状的药物载体对细胞分泌TNF-α的影响酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）能够检测单核细胞上清液中的TNF-α水平。肿瘤坏死因子（TNF-α）是至今被发现的具有杀伤肿瘤细胞作用和很强的生物活性的物质。早在八十年代，欧美就曾经展开临床研究，但是它本身的毒副作用较为严重，因此被迫中止。之所以能让研究者们继续深入的研究，是因为它具有特别明确的抗肿瘤作用。经过科学家们的不断努力，对TNF-α不断的研究，终于研制出了低毒并且高效的TNF-α变构体。终于在九十年代末欧美研究者再一次确定了TNF-α在治疗肿瘤方面的重要地位。因此，本文采用了ELISA法检测不同粒径大小及不同形状的药物载体对免疫细胞及癌细胞的影响。使用方法严格按照说明书操作。3.5.2.1ELISA检测不同粒径大小的CpGODN/脂质体复合体及CpGODN/类脂囊泡复合体对RAW264.7免疫细胞分泌TNF-α的影响在96孔板中，每一个孔中加入100µL（1×104-1×105个/mL）RAW264.7细胞悬液，而且每个实验组设3个平行实验，以防出现误差。再在每个孔中加入100µL没有胎牛血清的培养基。放入37℃，5%CO2培养箱，过夜；将96孔板从培养箱中拿出，倒掉上清液，每孔使用200µLPBS冲洗3次，加入不同的待测物：NT(未处理)：200µL无FBS培养基；5%葡萄糖：5%葡萄糖溶液100µL＋100µL无FBS培养基；脂质体：脂质体(105nm、256nm与600nm)30.3µL＋269.7µL5%葡萄糖溶液＋100µL无FBS培养基；类脂囊泡：类脂囊泡(127nm、298nm与800nm)30.3µL＋269.7µL5%葡萄糖溶液＋100µL无FBS培养基；CpGODN的5%葡萄糖溶液：浓度为500µg/mL；CpGODN/脂质体：40µLCpGODN＋40.4µL脂质体(105nm、256nm与600nm)＋100µL无FBS培养基；CpGODN/类脂囊泡：40µLCpGODN＋40.4µL类脂囊泡(127nm、298nm与800nm)＋100µL无FBS培养基；放入37℃，5%CO2培养箱培养6h；6h后制样，取上清液，离心（若试验无法连续完成，放置4℃冰箱）。使用仪器检测，在450nm处读取O.D值，计算出TNF-α浓度。3.5.2.2ELISA检测不同形状的CpGODN/脂质体及CpGODN/碳纳米管对RAW264.7免疫细胞分泌TNF-α的影响在96孔板中，每一个孔中加入100µLRAW264.7细胞悬液，每个实验组设3个平行实验，以防出现误差。再在每个孔中加入100µL没有胎牛血清的培养基，混匀。放入37℃，5%CO2培养箱，过夜；拿出培养箱中的96孔板，弃去上清液，PBS清洗3次，加入不同的待检测物：NT：200µL无FBS培养基；5%葡萄糖：5%葡萄糖溶液100µL＋100µL无FBS培养基；脂质体：脂质体30.3µL＋269.7µL5%葡萄糖溶液＋100µL无FBS培养基；碳纳米管：脂质体30.3µL＋269.7µL5%葡萄糖溶液＋100µL无FBS培养基；CpGODN的5%葡萄糖溶液：浓度为500µg/mL；CpGODN/脂质体：40µLCpGODN＋40.4µL脂质体＋100µL无FBS培养基；CpGODN/碳纳米管：40µLCpGODN＋40.4µL碳纳米管＋100µL无FBS培养基；放入37℃，5%CO2培养箱培养6h；6h后制样，取上清液，离心（若试验无法连续完成，放置4℃冰箱）。使用仪器检测，在450nm处读取O.D值，计算出TNF-α浓度。3.5.3CCK-8检测药物载体对细胞的毒性实验CellCountingKit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8的检测试剂盒。它被应用在很多方面，比如：细胞增殖实验和细胞毒性试验。它具有迅速、准确和灵敏度高的优点。如果存在电子耦合试剂，WST-8与线粒体内的脱氢酶发生氧化还原反应，生成甲臜产物（formazan）。甲臜产物的颜色很明显，为橙黄色，它是水溶性产物。颜色深表明细胞增殖快，毒性小；反之，颜色浅的话，细胞增殖速度慢，毒性大。在波长为450mm检测吸光度，如果吸光度大，证明活细胞数量多，细胞毒性小；反之，死细胞多，细胞毒性大。3.5.3.1CCK-8检测CpGODN/脂质体复合体、CpGODN/类脂囊泡复合体与CpGODN/碳纳米管复合体对RAW264.7免疫细胞的毒性实验每孔加入RAW264.7细胞混悬液100µL(1×104-1×105个/mL)至96孔板，每组设置3个减少误差，每孔加入100µL培养基，混匀。放入培养箱过夜培养，使细胞能够贴壁生长；取96孔板，弃去上清液，使用200µLPBS洗3次，加入10µL不同的待测物质：CpGODN/脂质体；CpGODN/类脂囊泡；CpGODN/CNT；CpGODN的5%葡萄糖溶液：浓度为500µg/mL；5%葡萄糖溶液；NT：200µL无FBS培养基;空白对照：不加药物，不接种细胞；在培养箱中培养6h，使得待测药物可以与细胞充分结合，发挥药效；6h后，取出96孔板，向待测的孔中加入CCK-8溶液10µL，尽量避免气泡的产生，否则会影响O.D值的测量。再将96孔板培养4h；4h后，使用仪器检测，在450nm处测定吸光度，计算出细胞死亡率。3.5.3.2CCK-8检测CpGODN/脂质体复合体、CpGODN/类脂囊泡复合体与CpGODN/碳纳米管复合体对U251癌细胞的毒性实验96孔板每孔加入100µL浓度为1×104-1×105个/mL的U251细胞混悬液，3组平行实验，每个孔中加入100µL培养基。培养箱过夜培养，使细胞可以很好的贴壁生长；取96孔板，弃去上清液，使用200µLPBS洗3次，加入10µL不同的待测物质：CpGODN/脂质体；CpGODN/类脂囊泡；CpGODN/CNT；CpGODN的5%葡萄糖溶液：浓度为500µg/mL；5%葡萄糖溶液；NT：200µL无FBS培养基;空白对照：不加药物，不接种细胞；培养箱中培养6h，使得待测药物可以与细胞充分结合，发挥药效；6h后，取出96孔板，向待测的孔中加入CCK-8溶液10µL，尽量避免气泡的产生，否则会影响O.D值的测量。再将96孔板培养4h，让CCK-8和待测物质结合的比较充分；4h后，在450nm处检测吸光度，并计算出细胞死亡率。3.6研究结果：不同粒径及形状的药物载体对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响3.6.1不同粒径大小的脂质体对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响表3-3脂质体的不同粒径对RAW264.7细胞的影响Tab3-3EffectsofliposomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells脂质体实验组TNF-α(pg/mL)NT645%葡萄糖溶液76CpGODN102CpG/Lip(105nm)148CpG/Lip(256nm)129CpG/Lip(600nm)119图3-4脂质体的不同粒径对RAW264.7细胞的影响Fig3-4EffectsofliposomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells图3-4实验结果表明，NT组、5%葡萄糖组及单独CpGODN组分泌的TNF-α浓度均小于100pg/mL，而粒径为105nm、256nm和600nm的CpGODN/脂质体复合体组分泌的TNF-α浓度均则处于100-150pg/mL。以脂质体为载体的CpGODN/脂质体复合体使得RAW264.7分泌TNF-α的量远远高于对照组及CpGODN单独细胞给药组。CpGODN/脂质体(105nm)复合体与对照组(NT,5%dex)相比，显著诱导了RAW264.7细胞分泌TNF-α(***P＜0.001)；与单独CpGODN组相比，分泌的TNF-α差异大(**P＜0.01)；而与粒径为256nm和600nm的CpGODN/脂质体复合体相比，粒径为105nm的CpGODN/脂质体复合体诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α差异显著(*P＜0.05)；而粒径为256nm和600nm的CpGODN/脂质体复合体对免疫细胞分泌TNF-α无显著差异。3.6.2不同粒径大小的类脂囊泡对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响表3-4类脂囊泡的不同粒径对RAW264.7细胞的影响Tab3-4EffectsofniosomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells类脂囊泡实验组TNF-α(pg/mL)NT765%葡萄糖溶液82CpGODN118CpG/Nio(127nm)202CpG/Nio(298nm)179CpG/Nio(800nm)156图3-5类脂囊泡的不同粒径对RAW264.7细胞的影响Fig3-4EffectsofniosomeswithdifferentparticlesizesonRAW264.7cells图3-5实验结果表明，NT组和5%葡萄糖组分泌的TNF-α浓度小于100pg/mL，单独CpGODN组分泌的TNF-α浓度为100-150pg/mL，而粒径为127nm、298nm和800nm的CpGODN/类脂囊泡复合体组分泌的TNF-α浓度均则处于150-200pg/mL。以类脂囊泡为载体的CpGODN/类脂囊泡复合体使得RAW264.7分泌TNF-α的量远远高于对照组及CpGODN单独细胞给药组。CpGODN/类脂囊泡(127nm)复合体与对照组(NT,5%dex)及CpGODN单独细胞给药组相比，显著诱导了RAW264.7细胞分泌TNF-α(***P＜0.001)；与粒径为298nm的CpGODN/类脂囊泡复合体相比，粒径为127nm的CpGODN/类脂囊泡复合体诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α差异显著(*P＜0.05)；和粒径为800nm的CpGODN/类脂囊泡复合体相比，对RAW264.7细胞分泌TNF-α有显著差异(**P＜0.01)。3.6.3不同形状的药物载体对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响表3-5不同形状的药物载体对RAW264.7细胞的影响Tab3-5EffectsofdifferentshapesofdrugcarriersonRAW264.7cells不同形状实验组TNF-α(pg/mL)NT595%葡萄糖溶液67CpGODN102CpG/Lip156CpG/CNT186图3-6不同形状的药物载体对RAW264.7细胞的影响Fig3-6EffectsofdifferentshapesofdrugcarriersonRAW264.7cells图3-6实验结果表明，NT组、5%葡萄糖组与单独CpGODN组分泌的TNF-α浓度处于50-100pg/mL，CpGODN/脂质体复合体组分泌的TNF-α浓度为100-150pg/mL，而CpGODN/CNT复合体分泌的TNF-α浓度均则处于150-200pg/mL。CpGODN单独细胞给药分泌的TNF-α比对照组(NT,5%dex)高，但差异不大；与CpGODN单独组和对照组(NT,5%dex)相比，针状的CpGODN/CNT复合体和球形的CpGODN/脂质体复合体更多，免疫作用更强。但与球形的CpGODN/脂质体复合体相比，细胞摄取针状的CpGODN/CNT复合体更容易，针状的CpGODN/CNT复合体使得RAW264.7分泌的TNF-α更多。3.6.4统计学分析本文使用Graphpadprism软件来处理相同制剂和不同制剂之间的数据，而差异统计学处理是通过单因素方差分析(onewayANAVO)和t检验进行的，*P＜0.05被认为有统计学差异。所有数据都是采用平均数±SD表示。3.6.5讨论RAW264.7分泌的细胞因子TNF-α在免疫激活方面起着很重要的作用。TNF-α具有杀伤肿瘤细胞的作用，并且具有很强的生物活性。纳米载体载CpGODN进入细胞，可以促进RAW264.7细胞分泌出TNF-α细胞因子，进而促进免疫应答。实验结果表明，与CpGODN单独组及对照组相比，CpGODN/脂质体复合体与CpGODN/类脂囊泡复合体都可以很大程度的增大与免疫激活相关的细胞因子TNF-α的水平。尤其是与较大粒径的脂质体和类脂囊泡相比，105nm的CpGODN/脂质体复合体与127nm的CpGODN/类脂囊泡复合体均有利于刺激RAW264.7分泌的细胞因子TNF-α，产生免疫应答作用。因此，本文可以得出结论，粒径较小的纳米颗粒载体在免疫佐剂治疗方面的表现更加出色。与颗粒粒径相似，纳米载体的形状对细胞及其在机体内的运动情况的影响也很重要。针状的CpGODN/CNT复合体比球形的CpGODN/脂质体复合体使得细胞分泌出更多的细胞因子TNF-α。这可能是由于针状的CpGODN/CNT复合体比球形的CpGODN/脂质体复合体更能有效地穿过细胞障碍到达细胞核内。RAW264.7对纳米载体有内吞作用外，针状的CpGODN/CNT复合体因为其针状的结构可能会直接穿过细胞膜进入细胞，使得RAW264.7对CpGODN/CNT复合体的摄取量增加，从而产生更强的免疫效应。因此，纳米载体颗粒和细胞之间相互作用在很大程度上受到颗粒粒径和形状的影响，不容小觑。3.7研究结果：细胞毒性测定3.7.1CpGODN/脂质体复合体、CpGODN/类脂囊泡复合体与CpGODN/碳纳米管复合体对细胞的毒性实验3.7.1.1CpGODN/脂质体复合体、CpGODN/类脂囊泡复合体与CpGODN/类碳纳米管复合体对RAW264.7免疫细胞的毒性实验表3-6CpGODN/Lip、CpGODN/Nio与CpGODN/CNT对RAW264.7细胞的毒性实验Tab3-6ToxicityofCpGODN/Lip,CpGODN/NioandCpGODN/CNTonRAW264.7cellsRAW264.7实验组TNF-α(pg/mL)NT965%葡萄糖溶液98CpG/Lip107CpG/Nio112CpG/CNT104图3-7CpGODN/Lip、CpGODN/Nio与CpGODN/CNT对RAW264.7细胞的毒性实验Fig3-7ToxicityofCpGODN/Lip,CpGODN/NioandCpGODN/CNTonRAW264.7cells图3-7实验结果表明，对照组NT(细胞悬液组)和5%dex组RAW264.7细胞的存活率接近100%，CpG/Lip、CpG/Nio与CpG/CNT的细胞存活率显著高于对照组的细胞存活率。由此可以推断出CpG/Lip、CpG/Nio与CpG/CNT细胞给药对免疫细胞RAW264.7细胞几乎无杀伤作用。CpG/Lip和CpG/Nio的细胞存活率稍微高于CpG/CNT，但是没有显著差异。3.7.1.2CpGODN/脂质体复合体、CpGODN/类脂囊泡复合体与CpGODN/碳纳米管复合体对U251癌细胞的毒性实验表3-7CpGODN/Lip、CpGODN/Nio与CpGODN/CNT对U251癌细胞的毒性实验Tab3-7ToxicityofCpGODN/Lip、CpGODN/NioandCpGODN/CNTonU251cancercellsU251实验组TNF-α(pg/mL)NT985%葡萄糖溶液97CpG/Lip83CpG/Nio82CpG/CNT78图3-8CpGODN/Lip、CpGODN/Nio与CpGODN/CNT对U251癌细胞的毒性实验Fig3-8ToxicityofCpGODN/Lip、CpGODN/NioandCpGODN/CNTonU251cancercells图3-8实验结果表明，对照组NT（细胞悬液组）和5%dex组U251癌细胞的存活率接近100%，但与其相比，CpG/Lip、CpG/Nio和CpG/CNT的细胞存活率就很低。针状的CpG/CNT的细胞存活率低于球形的CpG/Lip和CpG/Nio的细胞存活率，差异比较显著(*P＜0.05)。由此可以推断出CpG/Lip、CpG/Nio与CpG/CNT对U251癌细胞有杀伤作用，而CpG/CNT对U251癌细胞的杀伤作用更大。3.7.2统计学分析同“3.6.4统计学分析”方法分析。3.7.3讨论因为不同药物载体对细胞具有一定程度的细胞毒性作用，由CCK-8的原理发现：活细胞数量与其检测到的吸光度成正比。试验结果表明，CpGODN/Lip、CpGODN/Nio与CpGODN/CNT对RAW264.7细胞基本无毒，但对U251癌细胞均显示出具有一定的诱导癌细胞的坏死和凋亡的能力。而且与CpGODN/Lip和CpGODN/Nio相比，CpGODN/CNT对癌细胞的杀伤作用更大。这可能是与载体形状有关，载体形状对癌细胞的活性起着直接或着间接的作用，针状的CpGODN/CNT复合体比表面积较大，更易快速被癌细胞摄取，可能会直接进入细胞，表现出良好的杀伤作用。西安交通大学网络教育学院毕业论文4二甲基姜黄素脂质体和二甲基姜黄素类脂囊泡的制备与质量评价4.1二甲基姜黄素最大吸收波长测定精确称取适量二甲基姜黄素，置50mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，采用紫外分光光度法在200–600nm波长间进行紫外最佳吸收波长扫描，结果见图4-1。图4-1二甲基姜黄素最佳吸收波长测定Fig4-1Absorptionfordimethylcurcumin实验结果表明，二甲基姜黄素最大吸收波长为419nm，而空白囊泡与溶剂在419nm处均无吸收，说明此波长对于二甲基姜黄素的含量测定没有干扰。4.2绘制二甲基姜黄素标准曲线采用紫外（UV）法测定二甲基姜黄素的含量。在50mL容量瓶中精确称取二甲基姜黄素，用甲醇溶解并定容，得到浓度为0.15mg/mL的二甲基姜黄素贮备液。精密量取上述二甲基姜黄素贮备液适量，分别加甲醇稀释成浓度为3.0、6.0、9.0、12.0和15.0µg/mL二甲基姜黄素工作液。以甲醇为空白对照，在波长为419nm处测定各浓度二甲基姜黄素工作液的吸光度A，并以A值对质量浓度C进行线性回归测定，得回归方程A=0.0142C+0.001，r=0.9994。结果表明二甲基姜黄素在3.0-15.0µg/mL范围内与A线性关系良好，可用于二甲基姜黄素的测定。4.3包封率的测定方法精密量取二甲基姜黄素脂质体和二甲基姜黄素类脂囊泡2mL于透析袋，用无水乙醇破乳。置PBS溶液中透析24h（20r/min、37℃）。取经透析的二甲基姜黄素脂质体和二甲基姜黄素类脂囊泡溶液1mL，用PBS定容至10mL，摇匀，于419nm测定吸光度，通过公式计算包封率。包封率=（1-游离药物的量/类脂囊泡悬液中药物的总量）×1004.4二甲基姜黄素脂质体和二甲基姜黄素类脂囊泡的制备工艺4.4.1二甲基姜黄素脂质体的制备工艺用电子天平称取适量大豆卵磷脂、胆固醇和二甲基姜黄素（摩尔比4:4:1），分别加入适量氯仿，搅拌使溶解。将溶液混合倒入梨形瓶中，旋转蒸发仪旋干溶剂。真空干燥器中过夜，加入10mL5%葡萄糖溶液。超声波细胞清洗机超声5min，将溶液倒入15mL离心管。用超声波细胞破碎仪超声10min,即得二甲基姜黄素脂质体。4.4.2二甲基姜黄素类脂囊泡的制备工艺采用薄膜分散-超声法制备。在磨口圆底烧瓶中加入适量二甲基姜黄素、非离子表面活性剂和胆固醇溶于三氯甲烷-无水乙醇（4:1），搅拌均匀后，用旋转蒸发仪慢慢蒸去有机溶剂，至瓶底部形成均匀薄膜。加入PBS作为水合介质，在室温水浴超声仪中超声形成混悬液，再在冰浴条件下超声使之分散均匀，即得二甲基姜黄素类脂囊泡。4.5制备工艺优化4.5.1囊泡材料比例对包封率的影响4.5.1.1二甲基姜黄素脂质体本实验改变0.1mol/LDOTAP与0.1mol/L胆固醇的比例（1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、2：1、3：1、4：1）（w/w,n=3），固定二者用量为0.4mL，以药脂比为0.25:1制备二甲基姜黄素脂质体。考察不同囊材比例对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响，结果如下表4-1及图4-2所示。表4-1囊泡材料比例对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响Tab4-1EffectofDOTAP/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDOTAP:胆固醇EE%4:129.873:134.162:158.911:173.861:261.291:334.911:429.61图4-2囊泡材料比例对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响Fig4-2EffectofDOTAP/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomes实验结果表明：当胆固醇的量不变时，随着DOTAP的增大，脂质体对二甲基姜黄素的包封能力下降。当DOTAP的量不变时，随着胆固醇量的增大，脂质体对二甲基姜黄素的包封能力下降。当DOTAP与胆固醇比例为1:1时，包封率较高。说明DOTAP与胆固醇比例为1：1时，胆固醇刚好起到较好稳定双层膜的作用。4.5.1.2二甲基姜黄素类脂囊泡固定0.1mol/L司盘-60与0.1mol/L胆固醇溶液总用量为0.4mL，改变类脂囊泡载体材料司盘-60与胆固醇比例4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4（w/w,n=3），以药脂比为0.25∶1制备二甲基姜黄素类脂囊泡，考察不同囊材比例对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响，结果如下表4-2及图4-3所示。表4-2囊泡材料比例对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响Tab4-2EffectofSpan60/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomesSpan60:胆固醇EE%4:125.573:132.862:160.371:167.131:255.241:326.491:420.62图4-3囊泡材料比例对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响Fig4-3EffectofSpan60/CholesterolontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomes实验结果表明：当胆固醇的量不变时，随着Span60量的增大，类脂囊泡对二甲基姜黄素的包封能力下降。当Span60的量不变时，随着胆固醇量的增大，类脂囊泡对二甲基姜黄素的包封能力下降。当Span60与胆固醇比例为1:1时，包封率较高。说明Span60与胆固醇比例为1：1时，胆固醇刚好起到较好稳定双层膜的作用。图4-2和图4-3的实验结果表明：脂质体和类脂囊泡类似磷脂双分子层，具有流动性，但是流动的膜稳定性不好且包封率较低。胆固醇是膜添加剂，可以调节类脂囊泡膜的流动性，从而可以增加膜的稳定性，同时还可以降低渗透性，提高包封率。当胆固醇的量不变时，随着DOTAP和Span60量的增加，包封率越小。这可能是因为胆固醇减少，囊泡不稳定，导致包封率下降。4.5.2二甲基姜黄素用量对包封率的影响二甲基姜黄素用量直接影响脂质体和类脂囊泡的包封率。4.5.2.1对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响当DOTAP与胆固醇质量比为1:1，探究二甲基姜黄素用量分别为0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg（n=3）时对二甲基姜黄素类脂囊泡的包封率的影响，结果见下表4-3及图4-4所示。表4-3二甲基姜黄素用量对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响Tab4-3EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDimethylCurcuminDosage(mg)EE%0.152.370.264.250.3790.459.830.542.19图4-4二甲基姜黄素用量对二甲基姜黄素脂质体包封率的影响Fig4-4EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomes实验结果表明：随着二甲基姜黄素量的增多，药物包封率不断提高，当药物增加到0.3mg时，包封率最高。4.5.2.2对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响当司盘-60与胆固醇质量比为1:1，探究二甲基姜黄素用量分别为0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg（n=3）时对二甲基姜黄素类脂囊泡的包封率的影响，结果见表4-4及图4-5所示。表4-4二甲基姜黄素用量对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响Tab4-4EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminLiposomesDimethylCurcuminDosage(mg)EE%0.161.440.281.110.367.130.461.360.549.23图4-5二甲基姜黄素用量对二甲基姜黄素类脂囊泡包封率的影响Fig4-5EffectofDimethylCurcuminDosageontheEncapsulationEfficiencyofDimethylCurcuminNiosomes实验结果表明：随着二甲基姜黄素量的增多，药物包封率不断提高，当药物增加到0.2mg时，包封率最高。图4-4和图4-5实验结果表明：在脂质体和类脂囊泡没有达到药物饱和时，脂质体和类脂囊泡能够包封药物的量会随着药物总量的增多而增加。药物饱和之后，随着药物量的增大，包封率下降。所以当脂质体包封药物的量为0.3mg，类脂囊泡包封药