乳酸乳球菌suc-和nis+的转移

乳酸乳球菌suc-和nis+的转移

2.3生殖器是具有最广泛使用价值的二级代谢物2.3.1适用的乳酸球形ns许多抗菌药物可能是例如nisin、diphoin、lacocilin、bacurin、acidophilin和bulgarin。现已知道产生Nisin能力与质粒有关。大部分乳酸乳球菌菌种是由11种基因参与Nisin的合成,此11种基因称为NisinABTCIPRKFEG,而这些基因聚集在一个大的转座子上,其中nisA可转录出结构基因,而nisR可转录出一个反馈调节蛋白质,nisK可转录出一个组氨酸激酶NisK、NisR及NisK二者构成一个成分调节系统参与Nisin的合成。Gonzales等人研究了在乳球菌间Suc-和Nis+的转移。从乳酸链球菌ATCC11454上除去质粒pDR1(38.1Mdal)给予Lac-、Prt-、Suc+和Nis-;pDR21(29Mdal)缺乏给予Lac+、Prt+、Suc-和Nis+;质粒均丢失的二者给予Lac-、Prt+、Suc-、Nis-。通过提高温度,可能得到Lac-Suc+,Lac+Suc-,Lac-Suc-,诱导的乳酸链球菌新菌株。接合试验得出Lac+Suc+新菌株。Suc+Nis+和Nisin抗性从一个乳酸链球菌转移到另一个乳酸链球菌上。乳酸链球菌丁二酮亚种细胞在有DNAasel存在下,停滞于硝化纤微素中。对Suc+Nis+表型稳定性研究发现,当亲本菌株分别生长于37℃、40℃和42℃时,Suc-Nis-菌株的发生率分别为6%、5%和7%。可是当乳酸链球菌Suc+Nis+接合的菌株生长于上述温度下,未测出有Suc-Nis-菌株,同样乳酸链球菌丁二酮亚种的Suc+Nis+菌株生长在37℃或40℃时,他们的表型并不丢失。Nisin对热稳定性为pH=2,100℃/30min;pH=11,63℃/30min。Ruyter等人利用不产生Nisin的菌株乳酸乳杆菌NZ9800、3900等进行诱导表达,将NZ3900缺失了nisI和nisFEG基因,从而保留了nisRK基因,适合Nisin诱导。胞外多糖的产生,作者已在本刊第二期综述了这方面的研究情况。2.3.2乳酸链球菌胞外sod的生产老化与乳酸菌间是有关系的,近几年人们已认识到,过氧化类脂和自由基对老化起作用。老化与活性氧之间,特别是由酶和非酶反应产生的超氧化自由基已引起人们的注意,并且自由基引起的反应,脂肪的超氧化作用,对老化也有较大的影响。超氧化类脂的产生要求有不饱和脂肪酸或活性氧。辐射和金属离子对不饱和脂肪酸活化起作用,而活化氧的形式主要有:超氧化自由基(O2-)、OH-和单线态氧(1O2)。超歧化氧化酶(SOD)有助于去除这些氧的形式中的O2-、NADH氧化酶、NADH过氧化物酶OH及OH-作用。食品和药品中的这种酶的使用就是基于这种原理。Hansson等人研究了乳酸链球菌胞外SOD的产生,并对其有效提取方法进行了有效的研究。通过过滤发酵法生产SOD,发酵微生物为乳酸链球菌ATCC1943和相关菌株(SL)等,发酵条件为37℃,培养24h,然后通过离心收集得到(见表5)。以小丸形式饲喂鼠,正常剂量,时间从10周到27个月,并未发现有任何的毒副反应,也不产生血压升高等作用。而对来自于软骨基础的、防止老化的硫酸软骨素的保持,皮肤张力变化,阻止器官萎缩,以及与老化有关的骨骼肌,维持较底的血浆水平和正常水平的超氧化类脂含量。几种双歧杆菌产生的NADH氧化酶、NADH过氧化物酶及SOD活性如表6、表7所示。Sander等人将sodA启动子与lacZ基因接合,在有氧状态下,lacZ基因表现为无氧状态下的2倍。食品级乳酸菌优良特性,已引起食品、微生物、生物、医学等许多领域研究者的兴趣。利用遗传和生物技术培育抗噬菌体菌株;大量蛋白质产生乳酸菌菌株,提高乳糖代谢、蛋白质分解、SOD产生、抗噬菌体以及具有生物药理功能的EPS产生等特性方面,将产生极其重要的影响。利用过滤发酵、添加发酵等方法,在发酵产品、新药开发、生化制剂生产等方面将发挥巨大作用。3发酵生产技术3.1稳定ph值发酵法由于乳酸菌在发酵过程中,代谢产生的许多物质,例如乳酸、醋酸、细菌素等对自身生长反过来又具有抑制作用。因此消除这些代谢产物的抑制,并补充营养物质,可以较大幅度提高发酵剂中的乳酸菌数量。稳定pH值发酵法主要有过滤发酵法和连续流加碱发酵法两种。过滤发酵法是通过有效过滤膜将乳酸菌发酵过程中产生的有机酸等通过透析或超滤,从发酵液中加以除去;连续流加碱发酵法是根据发酵过程中产生的酸量,通过补加碱液,维持发酵液pH值的稳定。3.2冷冻浓缩发酵剂的使用效果过去20年间,发酵乳技术重大突破之一,就在于改变了传统液态发酵剂生产模式,冷冻、浓缩、干燥发酵剂在发酵乳生产中的应用。例如生产10万吨发酵乳,从母发酵剂到工作发酵剂,通常需要4代扩培;而利用1011冷冻浓缩发酵剂,仅需70～100g。直接使用冷冻浓缩发酵剂具有如下优点:1)可以防止菌种在保存、扩培过程中,菌种活性、组成发生变化;2)可以有效地防止有害菌的污染;3)发酵工厂省去菌种的逐级扩培过程,可以节省原材料和劳动力的消耗,降低成本;4)冷冻浓缩发酵剂产品质量均一,从而可以保证发酵乳产品质量的稳定;5)冷冻浓缩发酵剂活性可以预先进行测定,因此可以确保产品质量;6)冷冻浓缩发酵剂接种量小,可以精确控制,并且容易混合均匀;7)对于嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等,由于发酵剂生产厂在技术、人员方面的专一、生产过程的良好控制,从而防止了发酵剂的缺陷。4发酵液中成成分的改进原料乳的组成对发酵乳的品质有影响,对原料乳组成成分的改进是提高发酵乳品质的重要手段。发酵过程中的遗传和生物技术的应用,可望在节能降耗、提高制品品质以及生产出功能特性独特的发酵乳制品。4.1用牛乳生产马奶酒4.1.1模拟人乳在生产婴儿发酵乳制品中,参照人乳组成,对牛乳组成成分进行适当的调整,从而使之更适合于婴幼儿的饮用。目前国外这方面产品较多,如Lactana-B、Eledon、Pelargon、Femilact等,而我国在这方面还未进行有意识的开发。4.1.2用牛乳生产马奶酒用普通牛乳生产其他乳发酵制品,以解决这些原料乳不足的问题。例如用牛乳生产马奶酒就是一个例子。前苏联开发的用牛乳生产马奶酒的配方为:用34.6%全脂乳、0.8%脱脂乳、64.6%的非脂分离乳清,混合料的脂肪含量为0.9%～1.0%,容重为1.022～1.023kg/dm3。在使用前,干混合料用50～55℃的温水复原,然后用(85～87)℃/(5～10)min热处理,10～20MPa均质,并冷却至32～35℃,接种发酵剂,加入0.5L、0.2g/kg的维生素C溶液,接种量为20%,混合料在28～32℃发酵3～4h,并不断搅拌至酸度达70～80°T,冷却至16～18℃,搅拌发酵1～2h,罐装,于6～8℃成熟至成品。4.1.3适合于特殊病人的发酵乳这些特殊病人包括乳糖不耐症者,乳蛋白过敏(象苯丙氨酸)者等需要的发酵乳。4.2发酵乳生产中的生长促进物现已证实各种低聚糖对人体健康具有重要作用,并对乳酸菌,特别是双歧杆菌具有生长促进作用,因此各种生长促进剂在发酵乳生产中得到了应用,这些生长促进物主要是:(1)天然添加物,如玉米浸出物、西红柿汁、胡萝卜汁等。(2)各种低聚糖,包括乳果糖、低聚麦芽糖、低聚半乳糖等。在发酵乳产品中这些物质的添加,除可促进发酵微生物的生长外,另外残留于产品中的部分,随着食用进入肠道后,可促进体内有益菌的生长,特别是体内双歧杆菌的生长。4.3乳酸菌及其酶近20多年来,发酵乳的消费量逐渐增大,主要基于下述几方面的原因:(1)采用牛乳发酵而成,牛乳中含有各种对人体健康和营养需要的有益物质;(2)乳酸菌作为发酵剂菌种使用,有助于定殖肠道区域;(3)由于乳酸菌及其酶的作用,它们更有利于消化吸收;(4)它们含有乳酸菌代谢产物、原料降解产物以及良好的物理特性等。乳酸菌有关遗传及生物技术在发酵乳中应用如图2所示。5发酵乳液的营养和生理功能5.1对发酵乳的营养价值的影响乳酸菌在乳的发酵过程中,是对乳的预消化过程,除乳糖部分分解成乳酸、醋酸等有机酸外,蛋白质、脂肪也得到适当的降解,产生大量的氨基酸,并合成大量B族维生素,使乳形成良好的组织质地,提高消化吸收性能,同时也促进人体对Ca、Fe、P的消化吸收,因此发酵乳的营养价值大大提高。5.2发酵乳液的广告5.2.1抑菌效果的影响胎儿出身前,处于无菌状态,初生婴儿第一次排便(胎便)通常是无菌的。出生3～4h后链球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌等便出现于肠道内,经哺乳后,菌数迅速增加,至4～7天双歧杆菌开始占优势。健康人体中肠内菌群相当稳定,但可能因食物、药物、环境等因素影响而变化。发酵乳中的乳酸菌可以达到排除致病菌、维持肠道菌群平衡的作用:1)利用营养及上皮细胞的吸附竞争作用,以防止致病菌在肠道的定殖;或者由于大量乳酸菌的存在,形成生物膜造成屏蔽作用而防止致病菌接近上皮细胞。2)产生的有机酸降低pH值;或产生抑菌素、抗生素及脱结合型的胆酸等抑制致病菌的生长。5.2.2克氏原螯虾对大鼠的免疫作用抗肿瘤免疫反应中,巨噬细胞的杀瘤作用常具有重要意义。许多研究结果表明,乳酸菌及其发酵产品,均能激活机体的免疫系统,特别是巨嗜细胞、NK细胞和B淋巴细胞,而对T细胞本无直接作用。Vesely等人(1985)鼠的饲喂试验发现活菌和热处理的酸奶,至15天均能提高鼠的Ig?G2a和Ig?M,网状内皮细胞吞噬作用活性增强;从青春双歧杆菌ATCC15703培养物的上清液中分离得到的胞外物质,能诱导鼠肝细胞的脾变活性,从胞外物质中分离得到的EPS,显示出较高的淋巴增殖应答内部促进作用。瑞士乳杆菌约古特亚种产生的胞外多糖,对植入到鼠中的腹水肉瘤180具有抗肿瘤活性,可能是介于宿主介导的应答。由高加索乳杆菌和粪便菌株产生的开菲尔糖(kefiran)能提高肿瘤鼠的迟发型过敏性应答。因此可以看出,多糖免疫性的提高,是通过T细胞诱导的,而不是B细胞。来自于乳酸菌发酵乳或医疗制剂的外源乳酸菌比肠道固有乳酸菌具有更强的免疫促进作用,而且混合菌种比单一菌株的促进作用强。5.2.3其他方面的作用(1)对粪便酶的抑制作用动物试验已经证实,结肠中的细菌酶,特别是一些能催化致癌前体物质向致癌物质转化的粪便酶起源于粪便病原微生物菌丛,产生的这些酶主要是:β-葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、硝基还原酶、偶氮还原酶和甾醇7-α-脱氢木聚糖酶等。一些乳酸菌,如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等能耐受胃部不利条件而到达肠道的细菌,在抑制这些酶的生成及活性上起重要作用,其作用形式包括:1)代谢产生的乳酸、醋酸等有机酸,抑制病原微生物的生长和发育;2)代谢产生的一些细菌素,抑制有害微生物的生长;3)促进胃肠蠕动,减少致癌物质与上皮细胞的接触以及抑制粘膜上皮细胞的再生;4)形成不利于粪便酶作用的环境。(2)诱导NO的产生NO在哺乳动物机体的物质代谢、信息传递以及防御疾病方面起重要作用。目前很多证据表明,NO的诱导合成是活化的巨嗜细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制之一。NO可以通过下述两个可能机制杀伤肿瘤细胞。1)NO能与肿瘤代谢关键酶活性部位的Fe-S基结合形成Fe-亚硝基复合物,从而使酶失活,继而引起细胞毒性;2)NO能与氧结合,最终形成强有力的杀伤细胞的羟自由基和NO2。WPG和磷壁酸是NO合成酶的诱导剂。(3)抗突变活性致癌作用是通过具有致癌物诱导动物细胞突变开始的。一些乳酸菌可抑制动物细胞的突变。Hosono(1986)报道了德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳杆菌乳酸亚种制作的发酵乳,对4-硝基喹林-N-Oxide(4NQO)以及埃希氏大肠杆菌B/rWP2trpher诱导的突变作用,具有抑制活性。人体肠道固有乳酸菌对3-氨基-1,4-二甲基-5吡啶(4,4b)吲哚(Trp-p)和3-氨基-1-甲基-5H-5-吡啶(4,3b)吲哚(Trp-p)诱变基有较强的抑制作用。这些研究结果表明一些乳酸菌可通过抗突变作用达到抗肿瘤的目的。(4)参加或干扰细胞物质的代谢途径a.影响血液供应鉴于细菌素能引起肿瘤细胞出血性坏死,曾经设想多糖的抗肿瘤作用可能影响肿瘤细胞的血液供应。b.对细胞体积和空胞化的影响①多糖分子可以从腹膜腔吸附进入血液循环,然后活化多糖分子;其活化的部分扩散回到腹膜腔内以直接影响肿瘤细胞。②多糖分子或其一部分,可以刺激一种器官或组织(如肾上腺和网状内皮系统),再分泌一种物质作用于肿瘤细胞。(5)细胞膜接触抑制的功能DEAE-右旋糖苷,对于腹水肿瘤细胞,在体内和体外试验表明有抑制效应。早期的研究表明,肿瘤细胞表面具有强的负电荷,DEAE-右旋糖苷可能结合这些电荷,使细胞表面部分的“中和”,有利于细胞、细胞间的接触,接受信号以停止分裂。细胞表面电荷的中和,依赖于分子量的大小和取代程度,最大的效应是具有高分子量(2000000)和最高取代度(50%)。因此推断多糖的负电荷与抗肿瘤活性有关。乳酸菌作为一种非特异性生物反应调节剂,具有抗肿瘤的作用。目前对其机制的研究还很肤浅,今后应从分子水平探讨它对肿瘤细胞基因以及抑瘤基因的影响,同时对有效抗肿瘤成分尚需进一步深入探讨其结构与功能的关系,并运用现代生物技术、高密度发酵技术,培养活体细胞及有效代谢产物,为工业化生产抗肿瘤药物创造条件。5.2.4乳糖酶基因型由于发酵乳中约有20%～40%的乳糖得到分解,同时发酵乳中还含有较高的乳糖酶,能进一步参与分解乳糖;另外一些乳酸菌,如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等,能抵御胃肠不利的环境,而到达大肠,进一步分泌乳糖酶分解乳糖,因此发酵乳更适合于乳糖不耐症患者。5.2.5乳酸菌抑制胆固醇合成牛乳中的胆固醇经乳酸菌发酵后,其含量大大降低,且活性乳酸菌在人体内也具有抑制胆固醇合成能力,可能是因为乳酸菌能抑制羟甲基戊二酸辅酶A还原酶(hydroxymethylataryCoA),从而降低胆固醇含量的缘故。5.2.6组患者的含量下降双歧杆菌可抑制肠道中的腐败菌的繁殖,从而减少肠道中内毒素及尿素酶的含量,使血液中的内毒素和氨的含量下降。肝病患者使用双歧杆菌后,血中的氨、游离血清酚及游离氨基氮明显减少,尿中的游离酚及尿素氨也明显减少。另外乳酸菌产生有机酸、细菌素等能抑制肠道内腐败菌的生长,从而减少了这些细菌产生毒胺、靛基质、吲哚、氨、粪臭素、硫化氢、致癌物质和其他毒物等有害物质,使机体衰老过程变得缓慢。5.2.7乳酸菌代谢产物的活性口服乳酸菌的动物,经放射线照射后,比未服乳酸菌的对照动物存活时间长