牛子及其提取物对糖尿病大鼠肾脏gf

牛子及其提取物对糖尿病大鼠肾脏gf

对stz诱导的糖尿病大鼠进行了动物实验，并对大鼠动物模型进行了观察。1实验材料1.1实验动物采用清洁级3月龄♂Wistar大鼠,购于上海动物实验中心,饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级动物室,体重在180～200g之间。1.2配制工艺,符合以下规定牛蒡子购自上海中医药大学附属龙华医院中药房,经打粉、干燥、密封保存备用。1000g以95%的乙醇提取为200mL醇提液,1000g粉剂制成200mL水提液,1000g与普通饲料4000g混匀,做成药物饲料。1.3主试剂(1)模型试验链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司。(2)pco及ndps异硫氰酸胍:Gibco公司。SuperScriptⅡ(SSⅡ)逆转录酶:Gibco公司。Oligo(dT):Promega公司。dNTPs(四种各100mM):Promega公司。TaqDNA聚合酶:Biostar公司及华美生物工程公司。胃蛋白酶(Difico公司)、Ⅳ型胶原酶(Sigma公司产品)。(3)引物的筛选(由上海博彩生物技术有限公司合成。)检测大鼠TGF-β1的上游引物:TGF-UP:5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATGAC-3′,TGFβ1的下游引物:TGF-Down:5′-CTGCTCCACCTTCTTGGGCTTGCGACCCAC-3′;检测大鼠MCP-1上游引物:MCP1-UP,5′-ATGCAGGTCTCTGTCACG-3′,MCP-1下游引物:MCP-1-down:5′-CTAGTTCTCTGTCATACT-5′;检测大鼠β-Actin的内参引物:上游β-Actin-UP:5′-TGGGACGATATGGAGAAGAT;下游引物:BActin-Down:5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT。(引物由上海博彩公司合成,引物用无菌水配制成50mM储存)。1.4测试盒尿白蛋白放射免疫分析测定盒,北京北方生物技术研究所。糖化血红蛋白试剂盒:Roche公司。1.5仪器、检测设备OneTouchⅡ型血糖仪及其试纸:Lifescan公司。HITACH(日立)7170型自动生化分析仪,SN-682放射免疫γ计数器:中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂。RNA/DNA定量检测仪:Pharmacia公司。PCR仪:PE公司。电泳仪及水平式电泳槽:Bio-Rad公司。凝胶数码成像仪及图像分析系统:AlphaInnotech公司。光学显微镜及摄像系统:Nicon公司。2实验方法2.1动物的消毒照明大鼠饲养于本校实验动物中心清洁级动物室。实验期间,动物室温度控制在21～25℃,12h交替照明。大鼠自由饮水、进食,保持垫料干燥,每天换垫料2次。每笼大鼠不超过5只。2.2大鼠造模前后分组造模前将所有大鼠随机分为2组;造模组和正常对照组(E组)。造模后选取符合模型标准的大鼠,随机分为4组:A组:牛蒡子粉组;B组:牛蒡子水提组;C组:牛蒡子醇提组;D组:模型组。2.3枸杞酸缓冲液配制造模前大鼠禁食12h,链脲佐菌素(STZ)临用前用0.1mol·L-1,pH4.0的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度,以55mg·kg-1体重的剂量,ip72h后检测空腹血糖和尿糖水平,以血糖>16.7mmol·L-1且尿糖检测在+++～++++以上作为模型入选。正常组予以等量的枸椽酸缓冲液。2.4含药饲料含药确定造模大鼠达到模型标准后,稳定3d后开始ig用药。A组每只鼠每日予12g含药饲料(含生药2.5g)后,可自由进食。B、C组每只鼠每日予0.5mL药液(相当于2.5g生药的提取物)ig,D、E组每只鼠予0.5mL自来水ig。每天统计各笼大鼠的饮水量,每周统计各笼大鼠的进食量,每周称量各大鼠的体重变化。2.5肾重/体重检测用药后第6周时用代谢笼收集大鼠24h尿液,离心,计总量,保存于-30℃冰箱中。第6周末称量大鼠的体重,在无菌条件下,以戊巴比妥纳40mg·kg-1ip麻醉大鼠,腹主动脉取血约6mL,分别用于血肌酐及血脂等生化指标(2mL)、血常规及糖化血红蛋白(2mL)检测,所用的试管分别为普通管、肝素抗凝管。取双肾称重,用于计算肾重/体重比(即肾脏肥大指数)。双肾沿正中剖开,左肾置于10%中性福尔马林液中固定,用于病理检测;右肾置于液氮罐中,用于检测TGF-β1和MCP-1mRNA的表达等。2.6外周血糖化血红蛋白血肌酐、尿素氮等生化指标采用日立7170型自动生化分析仪检测。外周血糖化血红蛋白(HbA1C)采用罗氏(Roche)诊断试剂有限公司的糖化血红蛋白试剂盒检测。尿肌酐采用碱性苦味酸法,尿蛋白用考马斯亮兰法。2.7肾组织tgf-i和mcp-1mna的检测采用异硫氰酸胍法,具体步骤如下:2.7.1depc-1的制备(1)在RNasefree的1.5mL离心管中,加入2μg总RNA,0.5μLRNaseInhibitor(Promega),2μL100ng·mL-1Oligo(dT)15+18(15mer与18mer各50ng·mL-1,由上海博彩生物公司合成)和适量的DEPC处理的无菌水,使反应的总体积为9.5μl。混匀,65℃保温5min。取出室温放置10min。短暂离心将溶液收集到管底。(2)按下列次序加入试剂,进行RT反应:4μl5XFirstStrandBuffer(Gibco/BRL),0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100mMDTT(Gibco/BRL),2μl4XdNTPmixf(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM),1μ1200UMMLVReverseTranscriptase(Gibco/BRL)。(3)混匀,37℃保温60min。(4)90℃处理5min,冰上冷却,4℃离心将溶液收集到管底,RT产物直接用于PCR扩增。2.7.2变性约系的制备(1)引物同上所述;(2)扩增:PCR扩增条件如下:94℃45s,预变性120s,60℃退火45s,72℃延伸60s,循环35次,最后延伸300s。DNA扩增结果检测和半定量分析:DNA扩增产物用1.6%的Agarose电泳和EB染色后用TanonGIS-1000数码凝胶图象分析系统分析。3资料统计分析本文中数据统计均用SPSSVersion10.0(SPSSInc.,2000)完成,其中各组均数以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,资料统计采用One-WayANOVA法分析,方差不齐时采用DunnettT3法分析。统计显著性水平为P<0.05。4结果4.1中药对大鼠精神状况的影响正常组大鼠体重增长明显,精神状况良好,动作自如,反应灵敏,毛皮有光泽。DN模型组大鼠明显消瘦,多饮多尿、精神萎靡,反应迟钝,毛竖无光泽,动作迟缓。中药各治疗组精神状况均良好,动作自如,反应灵敏度较正常组稍差。造模组及各用药组大鼠进食量、饮水量均较正常组显著升高;各用药组进食量、饮水量均较模型组低。4.2各组大鼠血糖、糖化血红蛋白水平血肌酐、尿素氮:模型组与正常对照组高,差异显著(P<0.05),模型组比各用药组高,但无显著性差异。各用药组之间无显著性差异;牛蒡子醇提物组与正常组无显著性差异。血糖:模型组及各组用药组比正常组高(P<0.05)。各组用药组之间无显著性差异,P>0.05。各用药组血糖水平均低于模型组,但与之无显著性差异(P>0.05)。糖化血红蛋白:模型组比正常组高(P<0.05);模型组比各用药组高,但无显著性差异(P>0.05);各用药组之间及与正常组之间无显著差异(P>0.05)。4.3对牛子醇提物治疗大鼠血清中ndf的影响内生肌酐清除率(CCr=尿肌酐/血肌酐×尿量mL):模型组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。中药各治疗组较模型组明显降低(P<0.05)。牛蒡子醇提物治疗组比牛蒡子粉治疗组、牛蒡子水提物治疗组均显著降低(P<0.05)。24h尿蛋白:模型组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。中药各治疗组与模型组比较有明显差异(P<0.05)。4.4组疗效分析尿微量白蛋白(UAlb):模型组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。牛蒡子水提物治疗组与牛蒡子醇提物治疗组明显低于模型组(P<0.05)。各治疗组中,4周末时,牛蒡子醇提物组低于粉组及水提物组(P<0.05),6周末时,与牛蒡子粉组有显著性差异(P<0.05)。4.5血清tgf-m1rna表达水平本实验扩增的产物大小与预期值一致:目标片段TGFβ1400bp,MCP-1450bp;内对照为Actin240bp。RT-PCR的电泳结果见图1。TGF-β1mRNA表达:模型组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。模型组比正常组高,差异显著。各用药组比模型组低,有显著性差异;牛蒡子醇提治疗组及牛蒡子水提组与正常组相比较无显著性差异,此2组TGF-β1mRNA表达低于牛蒡子粉组,有明显差异(P<0.05)。MCP-1mRNA表达:模型组>牛蒡子水提物治疗组>牛蒡子粉治疗组>牛蒡子醇提物治疗组>正常组。模型组较正常组及各用药组高,差异显著;牛蒡子醇提物治疗组、牛蒡子粉治疗组比牛蒡子水提物治疗组低,差异显著(P<0.05),牛蒡子醇提治疗组与正常组相比较无显著性差异。5讨论5.1各组小鼠mcp-1表达比较MCP-1是最重要的趋化单核细胞在组织浸润的细胞因子。MCP-1是主要趋化、激活巨噬细胞的趋化因子,研究认为肾小球中单核细胞的浸润与ECM的积聚及肾小球硬化症的发展相关联,Rovin等研究表明DN时肾脏局部能合成MCP-1,且与肾小球损伤有关。本试验结果显示:牛蒡子醇提治疗组可减轻MCP-1mRNA表达,与正常组相比较无显著性差异,与模型组、牛蒡子水提物差异显著。提示牛蒡子提取物可能通过减轻MCP-1mRNA表达而改善糖尿病大鼠的肾损害。5.2大鼠ecm及tgf1基因表达变化众多实验及临床研究表明:糖尿病大鼠及糖尿病肾病患者活检组织TGFβ1mRNA的表达及蛋白含量均明显升高,同时伴肾脏肥大和细胞外基质增生,Shankland发现糖尿病大鼠2周时,其肾脏皮质TGFβ1mRNA表达较正常大鼠高2-3倍。Nakamura观察到糖尿病大鼠24周肾小球内TGFβ1比正常大鼠高4倍。TGFβ1在DN发病中作用可概括为:促使肾脏肥大,增加系膜细胞外基质的产生,并通过增加基质降解酶抑制物的活性,抑制基质降解酶合成,减少ECM的分解。研究证实糖尿病大鼠2周时,内生肌酐清除率及肾重/体重均明显高于正常组,同时伴有TGFβ1mRNA表达增加和TGFβ1蛋白表达增多。提示肾脏肥大及高滤过与TGFβ1升高密切相关。以往研究发现高糖本身及AngⅡ、AGES均有明显刺激TGFβ1生成作用,近来研究表明,蛋白激酶活性升高同糖尿病大鼠TGFβ1过度表达有关,可能同诱导c-fos、c-jun转导有关。大量研究表明,TGFβ1在促进肾小球病变发生、发展过程中起着重要作用,如调节肾小球固有细胞增殖,促进ECM合成和分泌,改变基质降解酶及其抑制因子的表达量和活性等。肾脏肥大可能与TGFβ1表达增强有关。TGFβ1可能为DN发病机制的最后通路:高血糖状态下,有多种生化异常及微循环障碍共同参与DN的发生发展,包括蛋白激酶C的激活、蛋白非酶糖化、氧化应激、肾素-血管紧张素系统活性增加等,它们可通过各种途径参与TGFβ1的调节,导致ECM积聚及肾小球硬化,其中高血糖、非酶糖化产物、NO以及血栓调节素对TGFβ1的作用与PKC的活性密切相关。它们都是通过或部分通过PKC来调节TGFβ。非酶糖化产物与TGFβ:糖化白蛋白(GA)能增加Ⅱ型TGFβ受体mRNA的表达。此外,在体内或体外实验中,AGES均可刺激TGFβmRNA的表达。本实验结果提示:各用药组可减轻TGF-β1mRNA表达,与模型组比较均有显著性差异;牛蒡子醇提治疗组及牛蒡子水提组与正常组相比较无显著性差异,与牛蒡子粉组相比有明显差异。5.3牛