四川农业大学研究生高级生物化学实验报告

实验一蛋白质相对分子质量的测定-凝胶层析法姓名：学号：专业：一、原理凝胶层析法(即凝胶过滤法，gelfiltration)是根据生物分子大小不同而将其别离开的一种方法，又称为分子筛层析(molecularsievechromatography)、排阻层析(exclusionchromate--graphy)。凝胶本身具有一种网状结构(即分子筛)，它可以把生物分子按大小不同进行别离，好似过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛〞与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，参加欲别离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程小．大分子由于直径大于凝胶孔径，所以不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒问的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到别离。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不管是天然凝胶还是人工合成凝胶，他们的内部都有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶〔agarosegel，商品名Sepharose〕，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-gel-P)和葡聚糖凝胶(SephadexG)，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被别离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高，空隙小，只有相应的小分子可以通过，适于别离小分子物质。相反，交联度低的空隙大，适于别离大分子物质。利用这种物质可别离不同分子量的物质。以下进一步说明其原理。将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积〞，以Vt表示，实质上Vt是由V0，Vi与Vg三局部组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vi为内体积，Vg为凝胶本身的体积，Vo为“孔隙体积〞或“外体积〞又称“外水体积〞。洗脱体积(Ve，elutionvolume)与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自参加样品时算起，到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被别离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=〔Ve-Vo〕/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得(g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量〞，以毫升/克表示)。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。以上关系可用图1表示。ⅢⅢ加样并开始洗脱加样并开始洗脱VeⅡViV0VeⅡViV0VeⅢ=V0+ViVeⅢ=V0+Vi图1凝胶层析柱洗脱的三局部示意图Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有以下几种情况：1、当Kd=0时，那么Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质(全排阻)，洗脱体积等于空隙体积〔图1组分Ⅰ〕。2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和〔图1组分Ⅲ〕。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差异，但不能有别离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们即使分子大小有不同，也没有别离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0<Kd<1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一局部可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化〔图1组分Ⅱ〕。4、有时Kd>1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差异更大，这是由于一局部水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一局部，因而不起作用，小分子不能扩散人内所致。此时Vi不能由g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的方法是不使用Vi与Kd．而用Kav(有效分配系数)代替Kd，其定义如下：Kd=〔Ve-Vo〕/ViVt-Vo代替Vi，那么：Kav=〔Ve-Vo〕/〔Vt-Vo〕即Ve＝Vo+Kav(Vt-Vo)这在实际上将原来以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相．而洗脱剂(Ve-Vo)作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差异较小，而对交联度大的凝胶差异大。Ve与相对分子质量的关系：对同一类型的化台物，洗脱特性与组分的相对分子质量有关，流过凝胶柱时，按从大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logMK1与K2为常数．M为相对分子质量。凝胶层析技术操作方便，设备简单，重复性好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的别离提纯，去除热原物质以及用于测定高分子物质的分子量。二、试剂和器材【试剂】1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000〔200KD〕，牛血清血蛋白〔67KD〕，胃蛋白酶〔36KD〕，CytC(13.7KD)等，均为分析纯。2、洗脱液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.5取0.5MKCl20ml，0.2MTris25ml，0.1MHCl40.3ml，再加H2O定容至100ml3、SephadexG-75〔或G-100〕。【器材】层析柱：柱管1*40cm；核酸蛋白检测仪〔或紫外分光光度计〕；局部收集器刻度试管。三、操作步骤〔一〕凝胶柱的准备1、凝胶的选择和处理[1]凝胶的选择：凝胶的型号很多，型号不同，筛分范围不同。市售的Sephadex的别离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。SephadexG型一般适用于别离蛋白质，假设用于别离核酸，那么限于其空间结构和所带基团的影响，选用高于他们分子量范围的型号，或那么选用适当型号的生物胶和Sephadex1。在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶SephadexG-25。当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类那么扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯化。一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子量差异越大，别离效果越好。[2]凝胶的处理：葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂的相同溶液中，充分溶胀后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后的床体积，计算所需凝胶于粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般多为蒸馏水、盐溶液或缓冲液，放置于室温，使之充分吸水溶胀。注意不要剧烈搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在100℃恒温水浴箱中加热溶胀，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌，排除凝胶内部包藏着的气泡。但是，必须防止置于酸或碱溶液中加热。凝胶颗粒最好大小比拟均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去。装柱前最好将溶胀好的凝胶置真空枯燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气。2、凝胶柱的制备[1]柱的选择：层析柱是所有层析方法的主要组成局部。因此，对层析柱〔包括体积和长度等〕选择的合理与否，将直接影响别离效果。当用同样直径的层析柱别离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱别离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱别离两种以上物质时，仍时层析柱长的比短的分辨率高。一般理想的层析柱之直径和长度之比是1：25～100。层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的结果可以重复。[2]装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径〔半径〕为1cm，如果样品样比拟多，最好用直径2-3cm柱。但假设直径太小时会发生“壁管效应〞，即在柱管中心局部组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响别离效果。一般说来，柱越长，别离效果愈好，但柱过长，实验时间长，而且样品稀释度大，易扩散，别离效果反而不好。一般来说，用于脱盐时，柱高50cm比拟适宜；在进行分级别离时，100cm高就已足够。装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，柱的下端缩口，底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。底下用棉花或玻璃纤维填弃。如用烧结玻璃砂板做底，尽管用细孔的〔3号〕，粗孔的那么要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降至柱高的1/4～1/3时，翻开柱下端出口，让溶剂慢慢流入，使柱上端悬浮液面缓慢下降至需要的高度。要注意颗粒间没有夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，再通过2-3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定，然后在凝胶外表上放一片滤纸或尼龙滤布，以防在加样时凝胶被冲起来。[3]凝胶柱的鉴定：红色葡聚糖或细胞色素C等配成2毫克/毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。如果凝胶是均匀的，没有“纹路〞、裂缝或气泡，才可以使用，否那么就必须重新装柱。要注意在任何时候不要使液面低于凝胶外表，否那么水分挥发，凝胶变干，别离效果变坏，并有可能混有气泡，影响液体在柱内的流动。3、加样加样量与测定方法和层析柱大小有关。测定样品含量的方法灵敏或床柱体积小时，加样量可少。否那么反之。例如，一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右〔柱体积2*60cm〕；当采用220nm观察消光读数时，加样量只需要1.2mg左右。加样量掌握得当，可提高别离效果。一般来说，加样量越少，或加样体积越小〔样品浓度高〕，分辨率越高。但用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。此外，样品的粘度也影响层析的分辨率，样品的粘度大比小分辨率低。因此，一般使用的样品粘度应小于2，或者与洗脱液的粘度相当为宜。加样的方法与一般柱层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小心加到凝胶柱上，翻开管夹，使样品溶液流入柱内。然后参加溶剂或盐溶液洗脱。4、洗脱所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变性或失活为原那么。洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否那么由于更换溶剂，凝胶体积发生变化而影响别离效果。洗脱所用的液体有水〔多用于别离不带电荷的中性物质〕及电解质溶液〔用于别离带电基团的样品〕，如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，中水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，如以此作为洗脱剂，可以减低吸附，将组分洗下。洗脱时的流速要严格控制。否那么收集的每一局部洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。假设无此装置，可用控制操作压的方法进行。事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。流速在洗脱液加在柱上的压力〔因液面差造成〕有关。凝胶层析与一般离子交换树脂不同，加压超过一个极限值，不仅不能增加速度，反而使流速急剧下降。流速对交联度不同的凝胶是不同的。对交联度大的凝胶〔G-10至G-50型〕，流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。对交联度小的凝胶〔G-75至G-200型〕，流速与柱的直径有关，并在一定的适宜操作压差下有最大的流速。流速亦受颗粒大小影响，颗粒大时流速较大，但流速大时洗脱峰形状较宽，颗粒小时流速较慢，别离情况较好。在操作时应根据实际需要，在不影响别离效果的情况下，尽可能使流速不致太慢，以免时间过长。5、柱的重新填装由于在洗脱过程中，所有组分一般可全部自柱上洗下，所以装好一次柱管之后，可以反复使用，无须特殊的“再生〞处理。但由于在使用过程中，颗粒可能渐渐沉积压紧，因此在使用一段时间后，流速可能渐渐减低，使一次分析时间拖长很久，这时需要将凝胶倒出，重新填装，或者用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行降沉。有时流速改变是由于柱顶上有灰尘集聚，那么需将外表层除去。由于葡萄糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠〔NaN3〕溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反响，也不改变他们的层析效果。也可用0.002%的洗必泰〔hibitane〕溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%〔0.01-0.02%〕三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60度以上时就要分解。在弱碱性溶液中也有用0.01%乙醇溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂，因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。6、凝胶的保存方法：凝胶用完后可用以下方法保存：(1)、膨胀状态：即在水相中保存，可参加上述防腐剂，或加热灭菌后于低温保存。〔2〕、半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60-70%乙醇洗，那么凝胶体积缩小，于低温保存。〔3〕、枯燥状态：用水洗净后，参加含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，那么凝胶水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽虑至干，于60-80度枯燥后保存。这三种方法中，以枯燥状态保存为最好。〔二〕用葡萄糖凝胶层分析法测定蛋白质的分子量：凝胶层析的操作方法如上所述。测定蛋白质的分子量根据需要可选用SephadexG-75,G-100或G-150型凝胶凝胶颗粒一般在40-120微米，柱管选用直径，高90-100cm。1、标准曲线的制定：层析柱用1X40cm，凝胶用SephadexG-75〔或G-100〕。[1]蛋白质标准样品混合液：分别称取4mg蓝色葡萄糖-2000〔分子量200，000〕、牛血清蛋白〔分子量67，000〕，胃蛋白酶〔分子量36，000〕，Cytc〔分子量：13，700〕共同溶于2mlPH7.50.025mol/LTris-HCl缓冲液中。[2]上柱和脱洗：将标准样品混合液上柱，然后用PH7.50.025mol/LTris-HCl溶液洗脱。用局部收集器收集，3ml/管，紫外检测仪280nm处检测。或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管的A值，以管号(或洗脱体积)为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积〔Ve〕。然后以蛋白质分子量的对数〔1gM〕为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。2、未知数品分子量的测定：完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测的洗脱峰位置，测出洗脱体积。〔三〕实验结果与分析1、洗脱曲线的绘制以管号(或洗脱体积)为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线如图2图2凝胶层析柱洗脱示意图2、洗脱体积表根据洗脱峰位置可以得出四种蛋白质的洗脱体积〔Ve〕，蓝色葡聚糖-2000=6*3ml=18ml；牛血清白蛋白Ve=7*3ml=21ml；胃蛋白酶Ve=8*3ml=24ml；CytcVe=12*3ml=36ml。其结果如下表1。表1四种蛋白质的相对分子质量与洗脱体积蓝色葡聚糖-2000牛血清蛋白胃蛋白酶Cytc洗脱体积Ve〔ml〕18212436相对分子质量200，00067,00036,00013,700相对分子质量对数5.34.84.64.13、选择曲线绘制以表1中蛋白质分子量的对数(lgM)为横坐标，Ve为纵坐标，得出选择曲线如图3。图3选择曲线4、结果分析凝胶层析柱洗脱示意图有较为明显的四个峰值，即在第6管，第10管，第14管，第21管，分别对应的OD值为0.195、0.140、0.119、0.300，再结合标曲，可以看出本实验大体上别离了4种蛋白，没有到达基线别离的效果。就其原因可能是加样时间间隔不够，洗脱速度稍快或者装柱不够均匀造成的拖尾现象。从标曲制作结果来看R2=0.8916<0.99，说明该标曲线性不佳，也间接显示出本次凝胶层析别离效果不佳。凝胶层析是生化实验中常用的实验，关键影响因素有：胶的选择和制备，即要求根据不同的别离目标选择不同的适宜的别离胶和洗脱液，制备过程中一定要保证胶的充分溶解吸涨。搅拌时动作要柔和，以免弄破凝胶颗粒和产生气泡。在装柱时保证柱子的均匀和防止气泡的产生。在层析过程中，保证一定的流速和电压，使洗脱尽力充分。5、原始数据记录表，如表2.表2原始数据记录表编号A280加样顺序10.012蓝色葡聚糖-2000〔200KD〕20.00530.00640.003牛血清白蛋白〔67KD〕50.01260.19570.130胃蛋白酶(36KD)80.02490.085100.140CytC(13.7KD)110.067120.024130.094140.119150.049160.027170.034180.016190.061200.235210.300220.202230.114240.070250.050270.010280.002实验二小麦种子储藏蛋白——HMW-GS的别离一、目的利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶〔SDS〕研究小麦种子储藏蛋白〔高分子量麦谷蛋白亚基HMW-GS〕组成结果。此外，SDS也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法，通过本实验，掌握SDS的根本原理、技术和应用。二、实验原理用十二烷基硫酸钠〔SDS〕和复原剂〔巯基乙醇或二硫苏糖醇〕热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被复原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量的负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构像均呈长椭圆棒状，各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中的迁移速度仅与亚基分子质量有关。因此，SDS可以用来别离蛋白质亚基并测定其蛋白质亚基的分子质量。三、实验器材和试剂1、仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、加样枪，烧杯50ml2个、移液管2、试剂和材料：(1)70%乙醇。(2)50%正丙醇〔含2%β-巯基乙醇〕250ml：正丙醇125ml，β-巯基乙醇5ml，加水至250ml。(3)样品提取缓冲液〔母液〕：4克SDS，11.5mlH2O，20ml甘油，25mlPH6.8、0.5molTris-Hcl，25mg溴酚蓝。(4)样品提取液：27.2ml母液+4.8mlβ-巯基乙醇+64mlH2O。或母液：水：β-巯基乙醇=1：1：0.02。(5)30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺〔Acr〕150g，甲叉双丙烯酰胺〔Bis〕4g定容至500ml。(6)别离胶缓冲液〔Tris-Hcl〕PH8.8：18.17gTris，用Hcl调PH至8.8定容至1000ml。(7)浓缩胶缓冲液〔Tris-Hcl〕PH6.8：15.1gTris用Hcl调PH至6.8g定容至250ml。(8)10%SDS〔W/V〕(9)10%〔W/V〕过硫酸胺。(10)TEMED〔四甲基乙二胺〕，4℃棕色瓶储藏。(11)电极缓冲液〔10X〕500ml：72g甘氨酸，15.15Tris，5gSDS。(12)染色液：45%甲醇+45%水+10%冰醋酸+0.02%考马斯亮蓝R250(13)漂洗剂：10%甲醇+80%水+10%冰醋酸。四、实验步骤1、样品的提取(1)取一粒种子研磨粉碎成粉状，参加70%乙醇1000ml，10分钟后，12000转离心8分钟，倒掉乙醇并晾干。(2)加50%正丙醇〔含2%β-巯基乙醇〕250ml混匀后，50℃水浴1.5小时，中途需要振荡，然后放入12000转离心8分钟。(3)取上清液加3倍体积丙酮置于-20℃冰箱2小时。(4)12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加样品提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸3分钟即可，再在12000离心3分钟。上清液用于点样。2、SDS—PAGE分析(1)组装电泳槽：见电泳槽使用说明书。(2)凝胶的制备：取两只干净烧杯〔50ml〕标号，按下表试剂配方进行配胶。在配胶前先用别离胶的十分之一封底，保证不能漏胶。然后再在电泳槽中先置别离胶，待别离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。别离胶用量15ml，浓缩胶用量5ml。表1凝胶的制备试剂配方聚丙烯酰胺凝胶组成别离胶〔10%〕浓缩胶〔3%〕30%丙烯酰胺〔Acr〕+甲叉双丙烯酰胺〔Bis〕ml2.50.62别离胶缓冲液PH8.8Tris-Hcl〔含SDSTEMED〕ml0.2-浓缩胶缓冲液PH6.8Tris-Hcl〔含SDSTEMED〕ml-13H2Oml2.95310%Ap过硫酸胺ul10075(3)加样及电泳待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子。然后将电泳槽注满电极缓冲液。取适量10和15ml上清液加样，在标准泳道点上高分子量标准蛋白质溶液。上槽接负极，下槽接正极，恒流20mA电泳，待溴酚蓝走出别离胶后30分钟停止电泳〔约2小时〕，取出玻璃板,剥胶染色。(4)染色剥下的胶用蒸馏水洗涤后参加染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色3分钟，每隔一分钟取出振荡，取出。(5)脱色将染色液倒回瓶内，参加漂洗液至背景无色，照相保存。3、结果处理量出染料和条带的迁移距离，按下式计算相对迁移率MRMR=样品迁移距离/染料迁移距离五、结果与分析结果如图1图1SDS条带图条带不是很清晰，可能是在制备凝胶时出现误差。出现两边翘起中间凹下条带。其原因是由于凝胶的中间局部凝固不均匀所致，这种现象多出现于较厚的凝胶中。条带出现拖尾现象，其原因主要是样品融解效果不佳或别离胶浓度过大引起的。四个样品中有三个条带的位置根本一致，说明四个样品中至少含有三种以上的相同蛋白亚基。根据不同条带颜色的深浅可以看出不同种类的蛋白亚基的含量是有差异的。又由不同相对分子量的蛋白亚基的迁移速度不同，可看出各蛋白亚基间的相对分子质量存在较大差异。实验三猪血中超氧化物歧化酶〔SOD〕的别离纯化及活力测定、同工酶电泳1概述SOD(SuperoxideOrgoteinDismutase)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，是一种含有金属元素的活性蛋白酶，是中国卫生部批准的具有药物功能的物质之一，法定编号为，CAS号：[905489]1。1938年Marn等人首次从牛红血球中别离到SOD，1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现其生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反响的性质，正式将其命名为SOD，到目前为止，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。SOD具有特殊的生理活性，在生物体内的水平上下是表观衰老与死亡的直接指标。现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。SOD可对抗和阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，故生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。SOD广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种能专一地去除超氧离子自由基(O2-)的金属酶。它具有抗衰老，抗辐射，抗炎和抗癌等作用，在医药、化装品、食品工业等方面具有了广阔的应用前景。1.1分类SOD以多个常见形式存在，以铜、锌、锰、铁、镍作为辅因子，按其所含金属辅基不同可分为三种：①含铜〔Cu〕锌〔Zn〕金属辅基〔Cu/Zn-SOD〕：是最为常见的一种酶，绿色，主要存在于机体细胞浆中。Cu/Zn-SOD是一个二聚体，分子量为32500，两个亚基主要通过疏水和静电相互作用结合在一起，铜和锌那么与活性位点上的组氨酸侧链形成配位键；②含锰〔Mn〕金属辅基〔Mn-SOD〕：紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。锰离子与三个组氨酸的侧链、一个天冬氨酸的侧链和一个水分子或羟基〔取决于锰的氧化态〕配位结合；③含铁〔Fe〕金属辅基〔Fe-SOD〕：黄褐色，存在于原核细胞中。在自然界中，Cu/Zn-SOD几乎存在于所有真核细胞中，而一些细菌只含Fe-SOD或Mn-SOD，还有一些那么两种都含有，Mn-SOD和Fe-SOD的活性位点具有同样类型的氨基酸与金属离子配位。在人体中〔哺乳动物和大多数脊索动物相似〕，SOD也含有三类：SOD1定位于细胞质中；SOD2位于线粒体；SOD3那么位于细胞外。SOD1为二聚体，而其他两类那么为四聚体。SOD1和SOD3的活性位点含有铜和锌，而SOD2那么含有锰。它们的基因分别定位于21号、6号和4号染色体〔〕。1.2作用原理有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反响，生成另一种物质—过氧化氢，过氧化氢又在过氧化氢酶的作用下和氢离子反响，最终生成了一种对人体无害的物质—水。在超氧化物歧化酶〔SOD〕、过氧化氢酶〔CAT〕、过氧化物酶〔POD〕三种酶的协同作用下，O2-最终转化为水，使机体得到保护。1.3功能机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD可去除人体内过多的有害的氧自由基，从而保护组织和器官免受伤害，具有重要作用。例如SOD最直接的功能是抗衰老和抗氧化；以此为根底，SOD可以有效预防慢性病和老年性白内障，降低辐射病风险及辐射防护、抗疲劳、防止二次伤害；SOD还能有效降低血脂、胆固醇、血压，可预防动脉粥样硬化，抑制心脑血管疾病；临床上还使用SOD治疗红斑狼疮自身免疫性疾病和初期肺气肿；目前，SOD最主要的用途是用于化解女性氧化危机，主要是用于美肤产品，现在已有多种产品进入市场，并具有很好的效果。2研究现状近年来，国内外的专家学者主要研究了SOD与植物抗逆性的关系。研究说明，在逆境条件下，植物的抗性与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。环境胁迫能诱导植物SOD基因的表达。当前，不同类型的SOD基因已被转化到多种植物中，有实验结果说明，SOD在转基因植物中的过量表达可以不同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力。因此，可利用基因工程方法来获得抗逆植株。2023年，张飞等人报道了黄芪多糖对早期断奶仔猪血清中SOD，MDA及NO的影响；高福元等人报道了冬季低温对4种彩叶植物SOD,POD活性影响的研究；周科等人报道了2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)污染沉积物对铜锈环棱螺肝胰脏的SOD、CAT和EROD活性的影响；2023年，刘等人报道了艾灸预处理后，GSH-Px、SOD和MDA活性对大鼠胃黏膜应激性溃疡的影响；刘红旭等人研究了参元丹后处理对心肌缺血/再灌注大鼠血清MDA,SOD水平的影响；2023年，薛铮等人研究了盐酸氨基葡萄糖对膝骨关节炎患者关节液中SOD和MDA水平的影响；梁迪思等人报道了北虫草不同部位超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的比拟；2023年，Haberle等人报道了SOD的构效关系及影响细胞的氧化复原为根底的信号转导途径；Paital等人研究了抑制剂，盐度和季节对泥蟹的超氧化物歧化酶表达调节同工酶的影响。3SOD测定方法SOD的催化底物是O2-·，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2-·自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。3.1直接法原理是根据O2-·或产生O2-·的物质本身的性质测定O2-·的歧化量，从而确定SOD的活性。经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法〔EPR〕、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵，一般较少应用。3.2一般化学法这些方法的共同特点是要有一个O2-·的产生体系和一个被O2-·复原或氧化的可检测体系。在SOD存在下，一局部O2-·被SOD歧化，因而O2-·复原或氧化检测体系的反响受到抑制。根据反响受抑制程度，测定SOD的活性。一般化学法有邻苯三酚自氧化法、细胞色素C复原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法、没食子酸法、6-羟多巴胺法、亚硝酸盐形成法和碱性二甲亚砜法。邻苯三酚自氧化法(改进Marklund法)原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm，同时产生O2-·，SOD催化O2-·发生歧化反响从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强，所需样本量少〔仅50μl〕，操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单等优点。细胞色素C复原法〔McCord法〕原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2-·使一定量的氧化型细胞色素C复原为复原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一局部O2-·被SOD催化而歧化，O2-·复原细胞色素C的反响速度那么相应减少，即其反响受到抑制。将抑制反响的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法原理是在有氧的条件下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤发生氧化反响生成尿酸，与此同时产生O2-·，O2-·氧化型细胞色素C复原为复原型细胞色素C，后者在550nm处有最大吸收。存在SOD时，O2-·被催化而歧化,细胞色素C复原反响速率那么降低。根据细胞色素C在参加SOD前后被O2-·复原的速率变化测定SOD活性。化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反响生成尿酸，同时产生O2-·。后者可与化学发光剂鲁米诺反响，使其产生激发。SOD能去除O2-·从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定，不仅灵敏度高，简便易行，而且特异性与准确性至少与细胞色素C复原法类似。免疫学方法上述方法测定的是SOD活性，免疫学方法那么可测定样品中SOD的质量，因此特异性较好，是较理想的测定SOD方法，免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，那么须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。电泳法电泳染色定位法原理是根据光化学法与NBT复原法。电泳那么采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色〔呈现棕色区带〕也可采取SOD活性负染色〔呈现无色透明区带〕。根据凝胶上电泳别离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。羟胺发色法原理是邻苯三酚自氧化产生的O2-·与羟胺反响生成亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐与氨基苯磺酸和N-甲萘基二氨基乙烯反响生成红色化合物，而SOD抑制此反响，根据抑制率上下计算活性。此外，SOD活性的测定方法还有氮蓝四唑(NBT)改进法、极谱氧电极法、碱性二甲基亚砜法、碱性连二亚硫酸钠法等。4蛋白质测定蛋白质的测定方法有很多种，主要有以下几种。4.1凯氏定氮法原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法样品的最正确消化条件为硫酸铜2.50g,硫酸钾0.10g,浓硫酸4.00mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素，硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最正确条件做实验，消化时间仅为12min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法比照，该法所需消化时间最短,试剂用量减少，可降低实验本钱，也降低了对环境的污染。凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。假设采用模块式消化炉代替传统的消化装置，可同时测定几份样品，节省时间，提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。4.2双缩脲法(Biuret)原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反响。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反响。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响，采用0.5g样品，40mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20mg蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。4.3紫外吸收法原理蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。特点最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用280和260nm的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用215与225nm的吸收差法。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差，故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收顶峰常因pH的改变而有变化,因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。4.4考马斯亮蓝G-250法本实验样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250〔CoomassicbrilliantblueG-250〕在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围在1～1000µg。原理Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸〔特别是精氨酸〕和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm，蛋白质在1～1000μg范围内，蛋白质－色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定特点考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反响十分迅速而稳定，2min左右即到达平衡，其结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好。该法方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、复原剂和络合剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。根据国际两学委员会规定，酶的比活性用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u/mg.pr)来表示。因此，测定样品的比活性必需测定〔1〕每ml样品中的蛋白质mg数(mg/ml)；(2)每m1样品中的酶活性单位数(u/ml)。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。本实验采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：规定条件下，每毫升反响液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量定义为一个酶活性单位(U)。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的吸光值与蛋白质含量成正比．可用比色法测定蛋白质含量，测定范围1-1000ug。5实验试剂与器材5.1试剂(1)SOD的提取：ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿(2)SOD活力测定：50mol/LpH8.3磷酸缓冲液、10mol/LEDTA钠盐溶液、3mol/L邻苯三酚溶液(3)考马斯亮蓝G-250法测蛋白质：考马斯亮蓝G-250试剂、标准蛋白质溶液5.2器材分光光度计；分析天平；具塞试管；刻度吸管；离心机；烧杯微量进样器。6操作步骤6.1SOD的提取(1)取新鲜猪血20mI[预先按0.15：1(v/v)的比例参加ACD抗凝剂]6000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球稠液，并且量其体积，然后参加2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/m，10min，弃上层清液，再入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，6000r/m，10min，得洗净的红血球浓稠液。(2)向洗净的红血球中参加等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢参加预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，再继续搅拌15min，6000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。然后将清液在65-70℃恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，6000r/m，5min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。(3)向粗酶液中参加等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过夜，6000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然枯燥即得淡蓝绿色成品。按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。6.2SOD活力测定6.2.1邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml50mmol/LPH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mol/LEDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即参加25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀．倒人光径1cm的比色杯内，用10mol/LHCI作空白，325nm波长下每隔30s测光吸收值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。6.2.2酶活力测定操作与(1)根本一致，参加邻苯三酚前，先参加一定体积的SOD样液，蒸馏水那么减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。6.2.3酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按以下公式计算酶活性：单位活性〔U/ml〕=A其中，A0：为邻苯三酚自氧化率；Am：加酶后邻苯三酚自氧化率；总活性〔U〕=单位活性×酶原液总体积6.2.4蛋白质合量测定(考马斯亮蓝G-250法)(a)标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表参加试剂。试剂管号123456蛋白质标溶液(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250(ml)555555蛋白质含量(ug)020406080100盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测光吸收值，比色应在1h内完成。以牛血清白蛋白含量(ug)为横坐标，光吸收值为纵坐标绘出标准曲线。(b)样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确参加0.1ml样品提取液，加0.9m1蒸馏水和5m1考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。(c)蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,计算其浓度。〔d〕结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数样品SOD比活力(u/mg)＝单位体积活力(u/ml)位蛋白质浓度（将测得的数据或计算结果填入下表。提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性(U/ml)总活性(U)比活性U/mg回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的7实验结果与分析7.1SOD活力测定将含有SOD的样1、样2及样3参加邻苯三酚自氧化过程的反响液中，记录加样体积及每30s观察的吸光度值，与邻苯三酚自氧化率测定过程吸光度值同记录如表1：表1邻苯三酚自氧化率吸光度值计时吸光度值A325邻苯三酚自氧化加SOD后的邻苯三酚自氧化样1a样2b00:00:300.0270.0240.02200:01:000.0610.0450.03300:01:300.0960.0560.04300:02:000.1290.0680.05400:02:300.1630.0790.06500:03:000.1930.0900.0