生物化学课件完整版(极其详细)

..PAGE1..word..第二章蛋白质第一节蛋白质的概念及其生物学意义一、什么是蛋白质？α—AA借肽键相连形成的高分子化合物（短杆菌肽含D-苯丙氨酸）OO［肽键：—C—NH—也叫酰胺键］二、蛋白质的生物学作用（或称功能分类）物质吸收与运输、运动，调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别（支架蛋白）、信息传递（受体复制酶）、记忆、疾病防御—抗体。应用：固体酶的工业应用（联于水不溶性树脂上）、脱（纺织品）浆（淀粉酶）、生化制药，蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等，都是利用蛋白质的催化作用，蛋白质生物芯片（贮存信息量大，将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上，能检测各种疾病蛋白及其他基因表达蛋白），进行病原体与疾病诊断等。第二节蛋白质的组成一、蛋白质的元素组成：C（50-55％）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱aa）（0-4%）有的还含有P（酪蛋白）、Fe、Zn、Mo（钼Fe蛋白）、Cu、I，特别是含N量都很接近，平均为16%。所以，测出含N量×6.25（100/16蛋白质系数）即可推测出蛋白质的含量——凯氏定氮。二、蛋白质的aa组成通常只有20种，除Pro外均为α—aa，除甘氨酸外，都有D、L两种异构体（α—碳原子为不对称碳原子）所以有旋光性。投影式如下：COOHCOOHH2N—C—HH—C—NH2RRL—αD—αaa的分类方法：（一）氨基酸的种类分类一根据侧链基团R的化学结构分为四类：第一类脂肪族aa：侧链是脂肪烃链①一氨基一羧基（中性）：一氨基一羧基aa中共九种：H—CH—COOHCH2—CH—COO－CH2—CH—COO－NH2OHNH+3SHNH+3(Gly:G)(Ser:S)(Cys:C)CH3—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－NH+3OHNH+3CH3NH+3(Ala:A)(Thr:T)(Val:V支链aa)CH3—S—CH2—CH2—CH—CُO－CH3—CH—CH2—CH—كOُ－(Leu:L支链aa)(Met:M)(Leu:L支链aa)(Met:M)CH3—CH2—CH—CH—COO－CH3NH+3(Ile:I支链aa)②一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺—OOC—CH2—CH—COO——OOC—CH2—CH2—CH—COO—NH+3NH+3(Asp:D)(Glu:E)OOH2N—C—CH2—CH—COO—H2N—C—CH2—CH2—CH—COO—NH+3NH+3(Asn:N)(Gln:Q)③二氨基一羧基aa（碱性：—NH2＞-COOH）H3N+—CH2（CH2—CH—COO—H2N—C—NH—（CH23—CH—COO—NH3+NH2+NH3+（Lys:K）(Arg:R)第二类芳香族aa（含有苯环的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp）：—CH2—CH—COO—HO——CH2—CH—COO—NH+NH+3NH+3(Phe:F)（丙aa取代）(Tyr:Y)第三类杂环aa：HCC—CH2—CH—COO—………—CH2—CH—COO—…HN+NHNH+3NNH+3CH（His:H咪唑基）(Trp:W吲哚基苯并吡咯)第四类脯氨酸，也称杂环亚氨基酸：由Glu还原、环化、再还原形成—COO——COO—NH2+(Pro:P)分类二按侧链R基团的极性（及在pH7左右时的解离状态）分为：非极性：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。不带电荷：带OH、SH、酰胺基极性带负电荷（酸性aa） 带正电荷：Lys、Arg、His(碱性aa).His等电点为7.59此外在蛋白质代谢中还有鸟aa、瓜aa（尿素循环中）、胱aa、羟脯aa、羟赖aa（胶原蛋白的组分）。甘aa的H介于极性与非极性之间，有时归入极性不带电荷类中。人和动物的必需aa：不能自身合成必须由食物获得。Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg*(*半必需aa，儿童合成不足)（二）aa的性质1.物理性质：无色结晶，易容于水，不容于有机溶剂，熔点高（ Gly：232℃,乙酸：16.6℃，分子间靠氢键缔合），这些特性说明是离子化合物。2.两性解离及等电点：（难点*）COO—加碱解离出H+带负电，加H+结合H+带正电，向阴极移动，在某一pH下带正、负电荷量相等。H3N+—C—H（由很酸向碱变化NH+3—CH—COOHNH+3—CH—COO—）RRR在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点（pI）。此时aa的溶解度最小（因为静电作用），pI与—COOH和—NH2的解离常数有关。K1：—COOH解离为—COO—+H+的解离常数；K2：H3N+解离为—NH2+H+的解离常数。其pI可从pK计算或测定(用酸碱滴定法测定)。aa等电点的计算：只有一个解离基团的物质AH，其解离常数与pH的关系为pH=pK+lg([A-]/[AH]).证明：AHA—+H+K=[A-]*[H+]/[AH][H+]=K*[AH]/[A-]=K/（[A-]/[AH]）-lg[H+]=-lgk--lg（[A-]/[AH]）即：pH=pK+lg（[A-]/[AH]）Henderson-方程。当有一半解离时，即[A-]=[AH]时，pH=pK，即溶液的pH可由其溶质的解离常数与解离量计算而得，溶质的解离常数可查得。pK：解离常数K的负对数。aa可看作二元弱酸（酸性条件）有两个可解离的H+其分步离解如下：K1（+OH－）在充分酸的条件下R—CH—COOHR—CH—COO—+H+NH+3NH+3（R+）（R0）K2R—CH—COO—R—CH—COO—+H+NH+3NH2（R0）（R—）[R0[R0][H+][R0][H+][R+]［R+］=∵K1=[R+]K1R0=R+时K1=［H+］[R-][H+]K[R-][H+]K2=R—=[R0][H+]用NaOH滴定到R0=R—时K2=[H+]等电点时：aa处于两性离子状态，可有少量解离成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。即：[R—]=[R+]即[R0][H+]/K1=K2[R0]/[H+][H+]2=K1*K2[H+]2=K1•K2—lg[H+]=pH；—lgK1=pK1；—lgK2=pK2两边取负对数得2×—lg[H+]＝—lgK1＋—lgK2即：pH=[pK1+pK2]/2=pI分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。即aa的等电点pI就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得，故pI值可由二pK值计算得之。对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。COOHCOO—COO—CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH+3K3Asp=CH2CH2CH2COOHCOOHCOO—Asp+(R+)Asp0(R0)Asp—（R—）等电点时Asp主要以兼性离子R0存在，(R+)与（R—）很小且相等（等电状态为理想状态，pI为理论值）。pI=（pK1+pK2）/2同上赖COOHCOO—COO—COO—CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH2K3CH—NH2（CH24（CH24（CH24（CH24NH+3NH+3NH+3NH2（R2+）（R+）（R0）（R—）pI=（Pk2+pK3）/2因R2+可忽略不计（pI时可认为它是不存在的，否则就不是等电状态了）。ε—NH2比α—NH2碱性强，结合H+能力大，结合后不易放出H+（因受COOH影响小）。3.氨基酸的化学性质：⑴与强酸、强碱都可生成盐（铵盐与羧酸盐）如谷氨酸钠⑵与水合茚三酮的反应80-100℃的条件下，首先使aa氧化脱羧脱氨形成醛，而本身被还原成还原型茚三酮，然后还原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚—二酮茚胺，这是α—aaOONHOOOHOHOOHOOOONHOHOOO—3H2O+NH3+（二酮茚-二酮茚胺紫兰色吸收峰570nm）Pro、羟—Pro生成黄色物质(因为无氨基)用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2，也可用CO2气体分析法测定aa（只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差。⑶与亚硝酸的反应（aa的NH2基被氧化成—OH），+NH3—N被氧化成N2，HNO2—N被还原为N2，等量进行。所以N2一半来自HNO2（其他伯氨基均可）。生成N2的反应叫vanslyke（X斯莱克）反应。可测N2量（体积）计算氨基的含量。用于测定蛋白质的水解程度。⑷与甲醛的反应：酸碱滴定没有适宜的指示剂（因为等当点过高或过低）。其氨基可与甲醛反应（加成），生成N—羟甲基或N，N—二羟甲基aa。使NH+3变为NH2释放出H+。使溶液酸性增强，可用NaOH滴定之。与NH2的含量相当，即aa含量。这就是aa的甲醛滴定法，（滴定到放出的H+被中和时的pH为终点）。R－CH－COO－R－CH－COO－+H++NH3NH2+HCHOR－CH－COO－NHCH2OH+HCHOR－CH－COO－N(CH2OH)2⑸与2，4—二硝基氟苯的反应（胺与卤代烷的反应）NH3的烷基化，生成黄色DNP—aa，不被酸水解。也可用之测肽和蛋白质的N—端aa，反应后酸解得N端的DNP—aa，有机溶剂提取分离，层析与标准氨基酸对比即可鉴定之。OO2NFNO2NCH3O=S=OH3ClDNFB丹磺酰氯Sanger试剂（5—二甲氨基萘磺酰氯）O2NNFNO2O2NNFNO2O2NFNO2+H2N—CH—COOH—CH—COOH因为丹磺酰aa有强烈的荧光，所以可用荧光光度计测定。（均在试剂与—NH2之间脱去卤化氢）均称Sangar反应。DNFB亦可与非α－氨基反应,如可生成：δ－DNP-鸟氨酸。+aaSRNH－C－NH－CH－COOHCONCNHCHSRN=C=S⑹与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应，称艾德曼反应（Edman）反应：弱碱性条件下，形成苯氨基硫甲酰aa(PTCaa)，在无水酸（硝基甲苯中与酸作用）环化为苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH或PTH-氨基酸）。PTH在无水酸中极稳定。+aaSRNH－C－NH－CH－COOHCONCNHCHSRN=C=SPTC基的引入使紧接着的肽键减弱，所以在无水酸中只切下之（环化断裂同时发生）PTH—aa在紫外区有强吸收。Vmax=268nm.PTH—aa可用各种层析技术分离，紫外分析测定与标准PTH—aa对比即可知为何种aa（N—末端），多肽、蛋白的N—末端aa也可与PITC反应，不断重复可得蛋白质aa顺序，多肽的aa顺序自动分析仪，即以此原理设计而成。一次可测60多个aa。7.成肽反应：肽即氨基酸脱水缩合而成的化合物R—CH—COOH+H2N—CH—COOHR—CH—CO—NH—CH—COOHNH2RNH2R二肽、三肽……含一个自由的α—氨基与羧基，还可缩合为多肽蛋白质活性肽：谷胱甘肽GSH*Glu的r羧基——Cys的α—氨基缩合成r肽键：SHCOOHOCH2OHCH—（CH2）2—C—NH—CH—C—NH—C—COOHNH22HHGSSG（氧化还原酶的辅酶—SH）催产素与加压素（激素类）：前者使子宫与乳腺平滑肌收缩二者只有两个aa不同：3Ile3Phe8Leu8Arg所以有催产和促排乳作用，后者则使血管平滑肌收缩使血压升高（也使肾小球血管收缩形成尿减少）（也是血压升高的原因之一）。所以也叫抗利尿激素，也与学习的记忆过程有关。均由下丘脑合成，神经垂体分泌入血H3H3N+S67899肽OCysS67899肽OCysSTyrPheGlnAsnCysTyrPheGlnAsnCysProArgGly—C—NH2升压素升压素C端Met脑啡肽：许多有镇痛作用：C端Leu（LC端Met似吗啡有镇痛作用但不上瘾似吗啡有镇痛作用但不上瘾（5肽）Tyr—Gly—Gly—Phe—Met促肾上腺皮质激素（ACTH39肽，脑垂体分泌）、胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥)胰高血糖素(29肽，胰岛α-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。与荧光胺反应（α—氨基）：产物具有荧光RN—CH—COOH+CO2OOOO+aaOHORN—CH—COOH+CO2OOOO+aaOHO荧光胺荧光产物（被390nm光激发，发射475nm的荧光）ng级9.与5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸）反应测半胱aa（Cys）等的游离—SH含量，生成含—SH的硝基苯甲酸产物OD412nm有一吸收峰可测之Cys的含量。SNOSNO2COOHSHOOCNO2SNO2COOHCH2—CH—COO－SHNH+3+HCysH5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸）硫代硝基苯甲酸Cys与抗性有关(吸收峰412nm)（三）aa制备与分析（可略）制备：蛋白水解：毛发水解（H+）胱aa、半胱氨酸发酵：Glu菌发酵Glu钠化学合成：α—酮酸+NH3aa分离：层析与电泳第三节蛋白质的结构蛋白质多肽链可分为四级结构。一、蛋白质的一级结构：其aa种类、连接方式及排列顺序，包括二硫键(共价键)。H2N—CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH—CO……—NH—CH—COOHR1R2R3Rn—NH—CH—CO—（称为aa残基）R成环则无书写：N端(氨基末端)：有α氨基的一端写在左边用H表示成环则无C端(羧基末端)：有α羧基的一端写在右边用OH表示连接方式：—CO—NH—。—S—S—与稳定肽链的空间结构和生物活性有关如胰岛素：51aa（分子质量5734）21A+30B667711192021OHHHOH研究方法：测定蛋白质的aa序列。Edman法一次只能测定60-70个aa残基的肽段单条肽链测定如下：1.测定aa组成。酸解、碱解，可避免多肽链的aa丢失。（测分子量确定aa个数氨基酸残基的平均分子量为120）2.测N、C末端aa。DNFB法等，确定肽链的数目，（羧肽酶A释放除Pro、Arg和Lys的所有C末端残基，羧肽酶B只水解Arg和Lys为C末端残基的肽键，二者合用）3.用两种以上的方法将蛋白质断裂为不同的肽段。如用不同的酶水解。4.分离各肽段，并测出它们的序列。Edman法5.根据各肽段的重叠部分推出蛋白质的全部aa排序。也可DNA测序后反推。关键是小肽段aa顺序的测定：Edman反应（降解法）与外肽酶酶解法。如：某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得4个小肽：A1:Ala－Phe；A2:Gly－Lys－Asn－Tyr；A3:Arg－Tyr；A4:His－Val胰蛋白酶酶解得3个小肽：B1:Ala－Phe－Gly－Lys；B2:Asn－Tyr－ArgB3:Tyr－His－Val.根据重叠结构拼接为：Ala－Phe－Gly－Lys－Asn－Tyr－Arg－Tyr－His－Val(可直接Edman法) 如果含两条以上的肽链先拆分成单链，若含二硫键需先拆开：过甲酸氧化形成二个半胱氨磺酸(或用β-巯基乙醇还原后用碘乙酸保护-形成羧甲基衍生物)：HCOOOH-CH2-S-S-CH2--CH2-SO3H+-CH2-SO3HHCOOOH含—SO3H，分析时即知—S—S—的位置（可先水解成只含一个或少量—S—S—的小肽段，以便确定—S—S—的准确连接位置）。二硫键位置的确定（另取一份样品）——++-——+熏蒸一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。提取DNA测序后反推蛋白：蛋白质抗体蛋白mRNA反转录cDNA测序反推（见后一章）。第三节蛋白质的结构多肽链可分为四级结构。一、蛋白质的一级结构：其aa种类、(共价)连接方式及排列顺序，应包括二硫键。二、蛋白质的空间结构多肽链按一定方式盘绕折叠，形成立体（空间）结构（各基团的作用力之故）。也称蛋白质的构象（或高级结构）：指蛋白质分子中所有原子在空间的排列及肽链的走向，以一级结构为基础。肽键及肽键平面，双键性质（不能自由旋转且比一般C-N键短，比C=N键长）OOO—CCα—C—N—Cα—C—N—CαC=NO与H成反式HHCαH亚氨基肽键中的4个原子—CO—NH—（—羧基与另一aa的氨基构成）和与之相连的两个Cα原子都处于同一平面上。这个平面叫肽键平面，Ｃ＝Ｏ有部分单键的性质，只有Ｎ—Cα，Ｃ—Cα键可以旋转。多肽的主链由许多肽键平面构成，平面可以Cα为顶点绕N—Cα和C—Cα键旋转，但受侧链基团的影响，只有少数的特定结构。所以肽链折叠有一定的限制，分为二、过渡、三、四级结构。1.Pr的二级结构：指多肽链本身的折叠与盘绕方式，驱使蛋白质折叠的主要动力来自各侧链基团及其与介质的相互作用（H键维持系统的能量平衡）。主要有α—螺旋结构、β—折叠、β—转角、无规则卷曲四种。1）α—螺旋结构：毛、发、羽毛中的α—角蛋白中的主要形式，多肽链盘绕成右手或左手螺旋（是由肽键平面绕Cα相继旋转一定的角度形成的）。典型的右手N①3.6aa残基为一圈，高0.54nm0.54/3.6=0.15nm，3600/3.6=1000②侧链R基伸向螺旋外侧相邻螺旋圈C=O与亚氨基（NH）氢间形成链内H键，每个残基的C=O都与它后面的第四个aa残基（隔三隔aa残基）形成H键，氢键平行中心轴。OHOH—C—NH—C—C—N—nS3.613(3×3)+4=133Rs：形成氢键封闭（合）环内共价连接的原子数，几乎全为右手螺旋（也有极少数左手螺旋）。但整条肽链并非全是，如有Pro存在时，即中断（无H可形成H键）。带同电荷的aa出现在邻近位置上就会影响螺旋的形成，甘氨酸也不易形成螺旋。2）β—折叠结构：O=CCNC 纵向排列形成片层N-HNNNNCN平行(角蛋白)反平行(丝心蛋白)β—折叠片层也可在同一肽链的不同部分之间形成。β凸起：β—折叠的一股弯曲使一个氨基酸残基突出出来不形成氢键。3）β—转角出现在180°回折角处，此处Gly、Pro多（侧链小才可形成），也叫发夹结构、回折、β—弯曲。OHOH—C—NH—C—C—N—nS310(3×2)+4=1024）自由回转（无规则卷曲）：无规则的松散结构。一种蛋白质中往往含几种二级结构2.超二级结构与结构域：相邻的二级结构的组合体（构象单元）在空间上能与其它部分分开，βαβ、αα、ββ（靠近）、β×β（连接链连接平行的β片层）、β曲折（β转角连接）、回形拓扑结构ααβ×ββαββ曲折左手超螺旋希腊钥匙构象超二级结构无特定功能（只有一定的组合规则，在空间上能辨认）。 结构域：是球蛋白的折叠单位，超二级结构进一步盘曲折叠成球状的，在空间上独立（相对）的、具有部分（一定）功能的结构，较小的蛋白可能只有一个结构域，这时结构域等于三级结构，超二级结构与结构域在结构上很难区别（后者比前者更复杂）。结构域的类型：β—圆桶、螺旋束结构域（后二者）等β转角相连3β转角相连7862541丙酮酸激酶溶菌酶肌红蛋白三级结构(单域)由两个以上结构域组合成三级结构（可以是完整功能的蛋白质）。每个结构域都有其功能，三级结构是指多肽链的所有原子在空间的排列与分布，如肌红蛋白的三级结构一条多肽链，非极性侧链埋于分子内部，极性基团分布在分子表面与水结合，所以具水溶性。有几个结构域常常就有几个功能区，结构与功能的统一。 两条以上肽链才有四级结构：分子量大的蛋白多由几条多肽链组成，它们以非共价键结合成一个功能单位，执行一个特定功能，其中一条肽链就称为该蛋白的一个亚基（Subunit）如血红蛋白由2α、2β亚基组成。β1β2以共价键连接的肽链不能称为亚基，如胰岛素A、B链以两个—S—S—键相连。四级结构：就是指亚基之间的连接及空间排列，不包括亚基内部得空间结构，亚基单独存在无活性或活性很低，只有聚合成四级结构，才能有完整的生物活性。如血红蛋白只有2α、2β（141、146aa）=574个aa一起才能组成完整的功能单位。 胶原蛋白：左手螺旋的多肽链缠绕成三股右手超螺旋的原胶原蛋白分子。胶原蛋白。三、蛋白质分子中的共价键与次级键（非共价键） 一级结构由共价键维持：肽键（酰胺键），二硫键；空间结构由次级键（非共价键）维持：氢、盐键（离子键）、疏水键、X德华引力（包括H键）。二级结构主要是H键，三级结构主要是疏水力，盐键、X氏力也都起着重要作用（维持特定构象）。四、蛋白质分子结构与功能的关系㈠一级结构：结构决定功能，相同的功能有相同或相似的结构1.不同动物的胰岛素XX小异（差异在A链：8、9、10、30位aa残基）。变化的aa不起决定（功能）作用；细胞色素C（呼吸链的重要组分）在动物间亲缘关系越近，差异越小，人与黑猩猩的差异小于人与鸡的差异。细胞色素C的结构中与之功能密切相关的部位在各种动物中都是不变的（104个aa组成）。2.关键部位结构上的一点变化，就会引起功能的显著变化。如：镰刀型贫血病。只是血红蛋白（2α：141aa，2β：146aa）的β链的第六位GluVal代替就使患者红细胞在缺氧时成镰刀状，易胀破、溶血，引起头晕、胸闷等贫血症状，都证明Pr结构与功能的统一性。㈡构象与功能的关系 构象：即空间结构。指取代基团，因为单键旋转所形成的不同立体结构。 别构现象：构象改变功能也随之改变的现象。 血红蛋白与O2的亲和力是很弱的，但其一个亚基与O2结合后引起的构象改变，亚基间次级键破坏，使其它亚基与O2结合力变大，结合速度变快。氧结合曲线成S型β1β2氧饱和度氧饱和度氧饱和度氧饱和度P(o2)P(o2)肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白的氧合曲线第四节Pr的性质一、分子量 大小：一般为1万——100万主要测定方法：1.超离心：在一定离心力下，分子量大沉降速度快。可用沉降系数来表示(正相关)。沉降系数：单位离心力下的沉降速度，cm/s/(cm/s2)单位（S：斯威伯格单位10-13秒）2.凝胶过滤：分子筛作用。分子量越大过滤速度越快，用标准蛋白作标准曲线与之比较即可知未知蛋白分子量。3.SDS凝胶电泳：分子量与迁移率成反比，与标准样品比较。（因为SDS使各种蛋白的荷/质比均相同）。大多数蛋白质与SDS按1:1.4(W/W)的比例结合SDS：十二烷基硫酸钠二、Pr的两性电离与等电点Pr也是两性电解质：解离基团：末端的α—氨基与羧基、aa残基侧链上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH等。NH2PrCOOHNH+3H+NH+3H+NH2PrPrPrCOOHOH—COO—OH—COO—pH＜pIpI=pHpH＞pI两性离子pI：使Pr所带的正电荷与负电荷相等，静电荷为零的溶液pH值。此时在电场中不移动，溶解度最小。pI：决定与Protein的aa组成，碱性aa多则pI大，否则小。电泳：带电物质在电场中移动的现象叫电泳。方向：取决于所带电荷的性质(正负)（后者又取决于溶液的pH值和蛋白质的氨基酸组成）。速度：取决于所带电荷的多少(正相关)和分子的大小(负相关)（荷质比）混合蛋白的分离：电泳自由界面电泳电泳纸上电泳醋酸纤维薄膜电泳区带电泳凝胶电泳圆盘电泳平板电泳等电聚焦电泳免疫电泳在pH8.6的电泳缓冲液中（各蛋白最大pI为6.35-7.3）滤纸电泳血清蛋白的电泳图如下：清蛋白α1—α2—β—γ—球蛋白+—三、Pr的胶体性质 大小：直径1—100nm，胶体颗粒：布朗运动、丁多尔现象、电泳现象、不能透过半透膜，具吸附能力（分子大表面具电荷和非极性基团），可用玻璃纸、火棉胶等透析纯化（去除小分子杂质），是生产上和实验室常用的纯化方法。 稳定蛋白质溶液的因素（不聚集成大颗粒而沉淀）：水化膜（层）与电荷pH≠pI四、Pr的沉淀反应 1.加高浓度盐——盐析：破坏蛋白质的水膜又中和其电荷。不同蛋白质所带电荷不同，所以，所需盐浓度不同，可分段盐析，（NH42SO4半饱和，球蛋白析出；（NH42SO4饱和，清蛋白析出（分子量小pI低），（只要pH＞或＜pI可以认为所有的分子均带同样的电荷，所以，在一定pH下的盐析与分子量有关：越大越易沉淀，pI过低或过高中和其电荷所需盐浓度高）。 2.有机溶剂沉淀： 极性有机溶剂与水的作用大于蛋白，破坏水膜，多同时调节pH使其接近pI(pI时消除了静电斥力)。多用乙醇。3.重金属盐沉淀(pH高于pI时)：蛋白质的重金属盐溶解度很小。沉淀 4.某些酸如：单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性盐而沉淀（pH＜pI），并破坏分子内氢键，使疏水性氨基酸残基移至分子表面，各分子靠疏水力结合。 5.加热变性沉淀：破坏分子内氢键，疏水基团外露，与水亲和力减弱，水溶性降低，水化膜破坏。如制豆腐：加热大豆蛋白的浓溶液，并加入MgCl2（盐卤）使蛋白凝固。 制取蛋白并保持其生物活性：盐析、低温下加有机溶剂沉淀，有机溶剂在高温或长时间接触会使蛋白质变性。五、蛋白质的变性： 理化因素影响，使空间（次级）结构，理化性质和生物学性质改变(但一级结构并未破坏)的现象。变性蛋白质的特点：①卷曲的肽链伸展，构象破坏；②生物功能丧失：酶的催化能力、血红蛋白的运O2能力、胰岛素调节血糖的功能。③溶解度降低、丧失结晶能力。因肽链松散，易被蛋白酶消化。变性因素：化学变性因素：强酸、强碱与尿素、胍盐、乙醇、重金属。 物理变性因素：超声波、紫外线、加热、震荡与搅拌。 变性的本质：次级结构破坏，但一级结构没破坏，所以分子量和组成不变。可逆或不可逆，胃蛋白酶的升温(80-90℃)与降温(37 应用：制作豆腐、尿蛋白检验(加热)、急救重金属中毒病人(给中毒病人吃大量乳品、浓豆浆或蛋清，然后催吐)等。制备蛋白与酶应防变性：应用低温等。六、蛋白质的颜色反应（分析测定的依据） 1.双缩脲反应（要求含两个以上肽键）OO 在碱性条件下能与CuSO4反应生成红紫色的络合物，具有双缩脲结构的物质都有此反应（二脲加热脱氨形成双缩脲：H2N—C—NH—C—NH2）与Cu++形成络合离子（两侧的氨基），540nm有吸收峰。OOOOOO—C—NH—CH—C—NH：含两个肽键的结构与双缩尿相似。 2.米伦（氏）反应：米伦试剂：硝酸、硝酸汞、亚硝酸与亚硝酸汞的混合液（millon,reaction/反应）与蛋白质相遇产生白色沉淀(加热后则呈砖红色)，酪aa等含酚基化合物都有此反应。3.乙醛酸的反应（Trp）将浓H2SO4加入蛋白质与乙醛酸的混合液，H2SO4与混合液成两层，两层间出现紫色环，为Trp与乙醛酸的缩合物，不含Trp的白明胶无此反应。浓H2SO4提供反应条件。4.坂口反应（精aa的胍基）Arg的胍基与次氯（溴）酸钠及α—萘酚在碱性条件下反应生成红色产物，可用于鉴定含Arg的蛋白及测定Arg的含量。5.酚试剂（碱性CuSO4及磷钨酸——钼酸）反应酚基（Tyr）可还原磷钼酸及磷钨酸为兰色的钼蓝与钨蓝。6.与水合茚三酮反应生成蓝紫色物质（似aa）7.黄色反应：Phe、Tyr的苯环与硝酸生成黄色的硝基苯化合物。8.与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀（Cys与胱aa含量）9.与考马斯亮蓝显色（595nm吸收峰）。G-250R-250第五节蛋白质的分类分简单与结合蛋白（按组分类）简单蛋白：水解只产生aa(α—)按溶解度可分为7类：清Pr、球Pr、谷Pr、醇溶Pr、组Pr、精Pr、硬Pr。清Pr：溶于水和稀盐溶液,在饱和硫酸铵溶液中沉淀。球蛋白：不溶于水，只溶于稀盐溶液，在半饱和的硫酸铵中沉淀，醇溶Pr：不溶于水和稀盐，可溶于稀酸、稀碱和70-80%的乙醇。谷蛋白：不溶于水和稀盐；可溶于稀酸、稀碱。精蛋白与组蛋白（碱性蛋白）：溶于水和稀酸，为碱性蛋白。硬蛋白：在水、稀酸、稀碱与稀盐溶液中不溶。主要存在于毛、发、角、爪、骨等组织中。结合蛋白：=简单Pr+非蛋白质组分（辅基），分为：1.核蛋白=Pr+核酸：核糖体、染色质2.糖蛋白=Pr+糖（共价键相连）糖的半缩醛羟基与Pr中的Ser、Thr等的羟基以糖苷键相连(O连接)或由糖的半缩醛羟基和Asn的酰氨基以N连接（脱水）。3.脂蛋白：蛋白与脂类通过非共价键相连。其蛋白部分称载脂蛋白，主要存在于膜上及动物血浆中，使脂类能溶于水中运输。血浆脂蛋白：按密度分为，乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白4类（CM、VLDL、LDL、HDL），其蛋白质含量依次增加，而脂类(包括固醇)含量依次减少。4.色（素）蛋白：其非蛋白辅基为色素如：血红蛋白=珠蛋白+血红素（原卟啉+二价铁），H2O2E、细胞色素C均由蛋白质和铁卟啉组成。铁卟啉NNCH由四个这样的吡咯环和亚甲基连接成环状的原卟啉.5.磷蛋白=蛋白质+磷酸（与Ser、Thr的羟基形成磷脂）。如：乳汁中的酪蛋白含有许多Ser磷酸残基(可结合大量钙)。有人提出按蛋白质的功能进行分类分为：酶（催化）、激素蛋白（调节）、运输蛋白（转运）、运动、防御蛋白（抗体）、受体、毒蛋白、膜蛋白。非活性蛋白：丝心Pr、胶原Pr、弹性Pr、角Pr。第二章核酸第一节核酸的概念与重要性核酸：细胞核内含磷的酸性物质DNA：核、叶绿体、线粒体。RNA：C质中。细菌转化实验（Avery艾弗里）,证明DNA是重要的遗传物质（从有毒肺炎双球菌菌株提取的DNA能使无毒的同类菌株转化成有毒菌株），为多核苷酸的高分子化合物。DNA：作为遗传物质，主要存在于细胞核中；真核细胞细胞器DNA只占DNA总量的5%。RNA：少数病毒的遗传物质。主要作用是转录DNA的遗传信息，并指导蛋白质的生物合成，现发现有的有酶样作用。主要存在于细胞质内，核内RNA只占RNA总量的10%。小RNA的作用（RNA剪切）是近年来的研究热点。第二节核酸的组成成分水解：核酸核苷酸核苷+Pi碱基+戊糖（嘌呤、嘧啶）（核糖、脱氧核糖）核糖与苔黑酚反应成绿色，脱氧核糖与二苯胺反应成蓝色一、核糖与脱氧核糖（分类依据）：β—D型。CH2OHHOH2CCH2OOHOOOCHOCH3β－D－型核糖β－D－2－脱氧核糖D－2－O－甲基核糖（RNA中）二、嘌呤(嘧啶并咪唑)碱与嘧啶碱： DNA和RNA各含四种碱基，嘌呤同。OHNNHOHNNH2NNNNNNNNH21C不足的键用H饱和H3H3C—NNNONOHNNNI次黄嘌呤1—甲基次黄嘌呤HHHHXOXOHNNNHONNNHOOHNNNNH2NH2黄嘌呤（酮、烯醇式）HHNNHOOHNNHHNO尿酸含氧的碱基有酮式与稀醇式两种互变异构体，酮式为主NHNH2OOOOHNNHNNNNN3N22NHONHO111HHHHHOOHNNHOOCH3HNNHOHHNHONHTUU的烯醇式嘧啶为碱性，六元杂环N原子的孤对电子不参与Pπ共轭，所以可与H+结合而显碱性，咪唑环为酸性，其N的未共用电子对参与了环的共轭，结合H+能力减弱其氢可以H+解离出来。显负电荷，故嘌呤碱可结合Ag+等。三、核苷：核糖或脱氧核糖与碱基（脱水）形成的糖苷，叫核苷。核苷中的糖苷键通常是由核糖的半缩醛羟基与嘌呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第一位N形成糖苷键，假尿苷：C′1—C5，戊糖C原子标号为1′、2′、3′……碱基环中的原子标号为1、2、3……OOOOHNNNNNNNH2OHOHOHOH2COHOHOHOH2CAU(ψ假尿苷/假尿嘧啶核苷)四、核苷酸：核苷中的核糖OH与Pi形成的Pi酯，核苷酸（也叫P—核苷）可分别形成2/、3/、5/—核苷酸脱氧核苷酸只有3/和5/—核苷酸，5/的居多。如AMP、GMP、dAMP、dGMP等。无特殊指明均指5/—核苷酸。+Δ水解DNA或RNA得5/或3/核苷酸或脱氧核苷酸，核苷酸通常指5/—核苷酸，pA：5/—腺苷酸，Cp：3′—胞苷酸，若为2/需标明：Gp2′：2′—鸟苷酸，2′—+ΔAMP+PiADP+PiATP是RNA合成的原料写出结构式！dATP、dGTP、dCTP、dTTP（脱氧胸苷酸）是DNA合成的直接原料。UTP参与糖合成；GTP参与蛋白质的合成。CTP参与磷脂合成。ATP：能量代谢。AMP：作为辅酶FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）、NADP+（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的结构组分。调节代谢：cAMP、cGMP、ppGpp（5′—二磷酸3′—2P鸟苷）、pppGpp、pppApp、pppAppp(休眠与逆境)、A5′pppp5′A(与细胞的生长速度正相关)。五、核苷酸的连接方式 DNA和RNA中3′—5′P二酯键，核苷酸的戊糖和P构成核酸大分子的主链，碱基构成侧链，P基呈酸性，在生理pH下带负电，嘌呤和嘧啶具有疏水性（DNA形成双链时碱基埋在里边）。每一链有—3′末端和一5′末端（长链状） P：磷酸基团。简写式：pApCpGpGpU（表示核酸酶的酶切位点）。p可略 简化式的读写：左5′右3′(中间以3′，5′—磷酸二酯键连接，如果不是应注明)。也是合成的方向！第三节DNA的结构一、一级结构：DNA分子中四种脱氧核苷酸的排列顺序。 生物大分子，分子一般在5000b以上。二、二级结构：双螺旋结构WatsonCrick1953提出。拉直后：5′3′ACGTGCATCTTTGCACGTAGAA3′5′1.内容如下：1）.DNA分子是由两条多脱氧核苷酸链组成的，方向相反5′—3′，3′—5′以它们的糖—磷酸为主链，以共同的中轴，绕成右手螺旋，表面有大沟（两圈间）和小沟（两链间）。2）．两条链上的碱基均在主链内侧（相对的两链中间）。且以氢键相连，形成碱基对AT、GC，其长度为双螺旋的直径2nm，AT间两个H键，GC间三个H键。互补配对原则。A的1位N与T的3位NH；A的6位氨基氢与T的4位氧形成氢键G的1位NH与C的3位N；G的6位氧与C的4位氨基氢，G的2位氨基氢与C的2位氧分别形成氢键！3）．参数：碱基对平面垂直螺旋轴，糖环平面平行于螺旋轴，每个螺旋圈有10个碱基对，每圈的高度3.4nm，相邻碱基对之间的距离为0.34nm，碱基堆积力(疏水力)和H键使双螺旋稳定，2碱基对间旋转的角度为36°（后来的测定证明每个螺旋含10.5个碱基对，高3.6nm）。 单链DNA（ssDNA）以碱基数表示其大小(b,nt)，如病毒φx174，M13。2.双螺旋结构的依据1）．X射线衍射图谱：不同来源的DNA图谱相似，呈两条具有螺旋结构的链，且有0.34nm和3.4nm两种周期性变化（碱基对与螺旋圈）WilkinsFranklin2）．层析法分析DNA的碱基组成A=T，G≡C（mol比）。查盖夫3）．P基可用电位滴定，嘌呤和嘧啶不能滴定，说明埋在分子内形成了氢键。DNA双螺旋的类型：类型旋转方向螺旋直径（nm）螺距（nm）每圈的碱基对数目碱基对间垂直距离nm碱基对与水平面倾角DNA75NaDNA92NaZ-DNACGDNA45LiDNAAT右右左右右2.32.04.53.092.431110129.3380.2550.340.370.330.30420°0°7°6°16°Watson.crick模型92%相对湿度的DNA钠盐称B—DNA。75%相对湿度的DNA钠盐，为A—DNA结构随条件而变化A-DNA与DNA-RNA杂交分子的构象及RNA双螺旋部分的构象同、短、粗。Rich的Z—DNA为人工合成的d（CpGpCpGpCpG）结晶，双链绕成左手螺旋DNA，P基在多核苷酸主链上的分布呈“Z”字形，所以叫Z—DNA。表面只有一个沟（另一沟很狭），d(AC)n也是-左手螺旋，用Z—DNA制得的抗体可与动植物细胞核中的DNA结合，说明天然DNA也有左旋DNA。改变相对湿度其螺距、每圈螺旋的碱基数、螺旋直径，碱基对平面的倾斜角等都发生改变，45%时称C—DNA（锂盐）。AT交替的序列：每圈8bp，螺距为2.43nm，碱基平面倾角16°，称D—DNA。T2噬菌体的DNA在相对湿度95%时呈B型，60%时呈D型（类似），说明DNA在体内是变化的。组成结构不同的部分螺旋结构也会有所不同。二核酸的结构：双螺旋单链三链(C-G-C或T-A-T)使DNA的ATGC不等。三链结构TTAGCACCACGATT四链结构：GGGGGGAATCGTGGTGCTAAGGGGGGTTAGCACCACGATTGGGGGGGGGGGG三、DNA的三级结构DNA双螺旋进一步盘绕扭曲即成三级结构。双链DNA的形式：线形、环状（dcDNA）超螺旋右手负超螺旋左手正超螺旋环状超螺旋（三级）L:连环数(二单链间缠绕数)；T:扭转数(总缠绕数)；W:超螺旋数环形DNA的不同构象L:连环数(二单链间缠绕数)；T:扭转数(总缠绕数)；W:超螺旋数环形DNA的不同构象在凝胶电泳中移动速度由快到慢的次序为：超螺旋-线形-松弛或开链环形(最慢)。松弛环形DNA（不解链，不形成超螺旋）生物体无解链环形：复制、转录时的状态负超螺旋：自然状态；复制转录时可形成正超螺旋真核生物线形DNA：绕组蛋白形成核小体（也是一种超螺旋）组蛋白：H1H2AH2BH3H核小体（粒）的核心各2分子念珠状结构进一步折叠、盘绕形成螺线管、突环、微带及染色体，共压缩8000-10000倍。超螺旋的形成有利于DNA的储存，解开有利于其复制与转录。第四节DNA与基因组一、DNA与基因复制、转录、翻译，DNARNAPr基因：DNA分子中最小的功能单位。分为结构基因：编码RNA或Pr调节基因：不转录成RNA，只起调节作用。某生物体所含的全部基因称为该生物体的基因组。人体基因组共2.5-3.5万个基因（也有报道3－5万）。人类的DNA共有约30（29-32）亿个碱基对（单倍体）。在所有DNA中，只有1-1.5％的DNA能编码蛋白，人类基因组（包括非基因序列）中98％以上的序列都是所谓的“无用DNA”，基因的平均大小为27kb.现已克隆出多个疾病基因和功能基因。二、原核生物基因组的特点（DNA利用充分冗余少），如，大肠杆菌基因组已搞清1.基因组小，只一个DNA分子，大部分为结构基因（编码蛋白），且为单拷贝。功能相关的基因连在一起，同时转录在一个mRNA分子中。如乳糖操纵子：ipｏｚｙａmRNAβ-半乳β-半乳糖β-半乳糖苷乳糖糖苷酶苷透过酶转乙酰基酶(乙酰转移酶)不同基因有重叠（甚至完全包含），读码框不同，利用充分。ABDE如，φX1744.细菌中含许多被称为质粒的小环形DNA，可在细菌间转移，可做基因载体。三、真核生物基因组的特点：基因组大，多个染色体，多个DNA分子。容量大其DNA序列有如下特点：1.有重复序列，如，GCATGGCATGGCATG……可以在不同染色体，或同一染色体的不同部位，由重复的多少可分为：1）.单拷贝序列：只出现一次或少数几次。主要是结构基因，人类占总DNA的50%2）.中度重复序列：可重复几十次到几千次。tRNA、rRNA及某些Pr基因在人类细胞中占总DNA的30-40%分为：散布重复序列和串联重复序列。3）.高度重复序列：重复万次以上至几百万次，多为小于10bp的短序列，不编码RNA或Pr，可能调控基因表达，富含A-T或G-C对，离心时在非重复序列旁形成单独带，所以称为卫星DNA。（简单重复序列SSR：可作为标记研究），位于基因之间的特定区域（异染色质区）。2.有断裂基因内含子（intron）：基因中不编码的序列、外显子（exon）：基因中编码的序列。一个基因可含有多个内含子，使基因成为不连续的断裂基因，也有无内含子的基因(如，组蛋白基因)。基因的功能部分断裂成：内含子数目＋1个片段！某些真核生物的断裂基因基因内含子数目基因内含子数目卵清蛋白卵类粘蛋白伴清蛋白α-珠蛋白76172β-珠蛋白δ-珠蛋白免疫球蛋白轻链免疫球蛋白重链2224分子杂交研究断裂基因：mRNA不与内含子区域结合而形成突环，结合电镜观察。intron可能有调节基因表达的作用。mRNADNA第五节RNA的结构与功能RNA一般为一条单链(也有双链)，可自身形成部分双螺旋（称为茎或臂）和突环，所以RNA是含短的不完全螺旋区的多核苷酸链。也可能相距很远的两部分间形成双螺旋！主要有三类m、t、rRNA。此外还有mRNA的前体hnRNA、snRNA、asRNA，结构功能各不相同。一、tRNA占总RNA的15%，运输aa，蛋白合成，一种aa可有几种tRNA，分子小。4S一级结构：核苷酸的排列顺序OHAOHACCtRNA三叶草叶型:35DDTψCDD可变环反密码环反密码环酵母丙氨酸tRNA的二级结构(反密码子IGC,密码子为GCU(C、A、G))双螺旋区称臂，不配对的部分称为环，四臂四环，含有较多的稀有碱基。如D、T（胸苷）、ψ（假尿苷）1.氨基酸臂7bp，3—CCA—OH与aa的COOH成酯连接2.D臂（3-4bp）3.D环（8-14b）含两个D(二氢尿嘧啶)4.反密码子臂（5bp）5.反密码子环（7b）：环中央含有与mRNA互补的反密码子。6.可变环（多为4-5b，可多至21b）7.TΨC臂（5bp）8.TΨC环（7b）GTΨC序列与核糖体5SrRNA的CGAA序列互补结合识别。不同tRNA有一些不变的核苷酸,所以结构相似。三叶草（叶）型的二级结构进一步折叠成倒“L”即“√”型的三级结构（x射线衍射图证明），aa臂、TΨC臂沿同一轴排列（12bp）的连续双螺旋构成L的短臂，反密码子臂与D臂沿同一轴排列，构成L的长臂，D、TΨC环构成倒L的转角（靠H键和堆积力稳定）。倒L型结构与核糖体上的空穴相符，可密切结合。GTΨC与5srRNA的碱基对互补。其他RNA也都如此：形成部分双螺旋及部分单链或突环(多环多臂)的二级结构，再进一步折叠形成特定的空间结构！二、rRNA(核糖体RNA)(80%)原核生物30S:16SRNA(21Pr)真核生物40S(33Pr):18SrRNA核糖体70S50S(34Pr):5S，23S核糖体80S60S(50Pr):5S，5.8S，28SrRNA16SrRNA：多半核苷酸形成链内碱基对，形成多环、多臂结构。其结构与30S亚基的形状和大小非常相似（似动物胚），其近3′端有CCUCC序列与mRNA近5′端的SD序列（GGAGG）互补，说明其结构与核糖体的构成和蛋白质的合成有关，参与核糖体与mRNA之间的识别。最大rRNA(23S)的构象决定了核糖体大亚基的形态（三叉椅子框架），一级结构均已搞清。5srRNA的二级结构：（图）含CGAAC序列与GTψCG互补三、mRNA与hnRNA占总RNA的3－5%，寿命短，原核生物(无核)转录、翻译可同时发生（因为①原核生物转录翻译在同一空间进行。②基因无内含子）。mRNA转录后无需加工。真核生物:核内转录，在细胞质中翻译，且基因内有内含子，转录后需加工，才能用于指导蛋白质的合成。前体hnRNA切除内含子剪接5′端戴帽（7—甲基G）、3′加尾polyA（100-200），成为成熟的mRNA.四、snRNA、asRNAsnRNA：核内小RNA（胞质中称scRNA），58-300b5＇端有帽（N2，N2，7－三甲基鸟苷），内含U多的U—RNA：U1、U2（电泳呈不同的带）；无帽的按沉降系数排号4.5s7sRNA等。控制细胞分裂与分化，物质运输等。参与mRNA的剪接及蛋白质合成的调节。在哺乳动物细胞核内，至少发现10种snRNA，分别命名U1～U10。snRNA不单独存在，常与多种特异的蛋白质结合在一起，形成小分子核蛋白颗粒（snRNP）。snRNPs在mRNA剪切中起重要作用（识别酶切）。asRNA：反义RNA与mRNA互补结合抑制其翻译，由基因的有义链转录而来，也可抑制DNA的复制(与引物RNA互补结合)及转录。五、RNA的其他功能具有酶活性的催化RNA（核酶），参与RNA的加工，调控代谢，既可作为遗传物质，又可起蛋白质的作用。所以生命起源可能是由它首先产生的（现认为），之后随着进化，分工精细，才出现不同的蛋白质。调节mRNA的降解（小的双链RNA(21－28nt)可以高效、特异的阻断体内特定基因的表达，促使其同源序列的mRNA的降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(干涉),简称RNAi，RNAi可被用来代替费时费力的基因敲除、进行基因治疗、基因功能研究等。RNA干扰获2006年诺贝尔医学奖。第六节核酸的性质一、一般理化性质酸性的两性电解质:有酸碱基团，可溶于稀碱0.04MNaOH。2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，都微溶于水，不溶于有机溶剂，可用乙醇沉淀。DNA、RNA均可溶于盐溶液，0.14mol/LNaCl，RNA溶解，DNA不溶可分离之；再用酚/仿/异戊醇，变性除去蛋白，再用乙醇沉淀制得。3.DNA分子大，可达几个cm呈线型，所以溶液粘度大；RNA小，呈线团状，溶液粘度小，。4.RNA可被酸、碱、酶水解，DNA对碱（37℃，0.5M5.D－核糖与浓盐酸和苔黑酚共热（100℃）产生绿色产物。糠醛D—2—脱氧核糖在酸性条件下与二苯胺作用产生兰色物质，所以可分别测定RNA与DNA的含量（酸性条件），或区分二者。二、紫外吸收性质嘌呤与嘧啶均构成共轭双键系统，吸收紫外光（260-290nm），吸收峰在260nm，蛋白质在此处也有微弱的吸收（吸收峰在280nm），纯DNA，OD260/OD280=1.8，RNA为2.0，样品中如含有杂蛋白及苯酚，OD260/OD280比值会降低，不纯的样品不能用紫外吸收法进行定量测定，对于纯的样品只要读出260nm的OD值，即可算出含量(因1µg/ml的DNA溶液260nm的吸光值为0.020，RNA为0.024(0.025)，含量＝OD260/0.020)。在层析纸上则熄灭荧光（吸收紫外光）(滤纸或其他载体在250－290nm的紫外光下发出浅蓝色荧光)，可确定其位置与大致含量。将其水解成核苷酸则紫外吸收值增加。这是因为，DNA双螺旋结构中的碱基紧密地堆积在一起（一些碱基吸收不到紫外光）造成的。三、核酸结构的稳定性（空间结构）1.碱基对间的H键，DNA、RNA双螺旋区及RNA形成三级结构时单链突环间的bp间的H键是稳定二、三级结构的重要因素。2.碱基堆积力疏水作用力与X德华作用力3.环境中的正离子、组蛋白、多胺等与核酸的磷酸基结合，消除静电斥力，维持稳定。纯的核酸不如在体内稳定，通常保留在盐溶液中。四、核酸的变性：指核酸双螺旋（双链间）区的H键断裂形成单链的过程，不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。3′，5′磷酸二酯键的断裂，称为核酸的降解，与蛋白质变性相似，均为次级键的破坏。1.变性的判断：紫外吸收值增加称增色效应（碱基外露之故）。 粘度下降（形成了无规则线团，表面积减小），密度增大（同前），生物学功能部分或全部丧失。 破坏氢键(加热)，妨碍碱基堆积（有机溶剂）和增加P基的静电斥力（提高pH）即可加速变性。热变性（打断氢键）和TmA/260nmA/260nm75Tm808590T/℃加热DNA的稀盐溶液至80-100℃使OD2603.影响Tm的因素主要有：1）DNA的G—C对含量，（G+C）%=（Tm-69.3）*2.44计算时去掉%2）溶液的离子强度.高离子强度则比较稳定，Tm较高。纯水中很易变性。3）pH值：高pH时碱基去质子，形成H键能力减小，同时二链间的P基的负电荷使二链互相排斥，易于解链，Tm降低，所以，加NaOH可维持变性状态，pH过低嘌呤易脱落。4）甲酰胺、尿素、甲醛等变性剂可破坏氢键，妨碍碱基堆积，Tm下降，所以，常用之维持电泳中的变性状态。五、核酸的复性（变性的逆过程）变性核酸（DNA）在适当的条件下重新结合为双螺旋的过程称为复性。 热变性的DNA复性必需缓慢冷却，所以又叫退火（与淬火：浸入冷却剂中迅速冷却相对），骤然冷却不能复性（所以同位素标记的双链DNA片段作为杂交的探针时），在沸水浴中加热数分钟变性后，骤然在冰水浴中冷却至低温，以防止复性（使之固定在单链状态），复性时单链随机碰撞，Tm—25℃影响复性速度的因素：1.单链片段浓度：正相关。碰撞机会多。2.单链片段的大小：负相关，形成错配时（因为不稳定，形成的氢键少）会分开再重新配对（正确配对的机率随碱基对增加而减小）。如：……GACCCTATTGGGTTC…………CTGGGATAACCCAAG……下链的前一个AA若与上链的前一个TT配对就会形成稳定的双链，但若与后一个TT配对就会形成很不稳定的部分双链。3.片段内的重复序列多，则复性快，易于整体结合配对。或形成更多的碱基对。4.一定的离子强度可消除P基的负电荷斥力，从而使复性加速。六、分子杂交不同来源的变性的DNA或DNA与RNA一起退火形成杂合双链的过程叫分子杂交, 它可测定染色质中的基因拷贝数、位置、确定亲缘关系(能否杂交)等，将DNA或RNA引入放射性或荧光标记，做成探针，杂交后据此即可寻找与之互补的DNA或RNA。原位杂交：用探针与C中的核酸经变性后直接进行杂交。不改变核酸的位置（染色体上）。点杂交：也可将核酸提取出来，点在膜上与探针杂交。狭线杂交（印迹）：点样形状呈狭线形（用特制的加样器加样）。杂交过程：①将样品DNA用限制性内切酶切成大小不同的片段。②凝胶电泳分离③碱变性后转移（扩散）到硝酸纤维素膜上（转膜）④与探针杂交，因为由Southern发明故称Southern印迹法。Southern杂交技术，分离分析RNA的技术称为Northern杂交。注：①结合不一定是完全形成双链，故可能出现部分杂交。②在不同片段上都有显示，说明与探针相同的DNA可有多拷贝。③若杂交带发生了变化（同时又有病症），就可能是病症的原因。④探针未必完全清楚，只知其来源且是某一限制性酶切的某一片段即可（扩增后作成探针）。第七节核酸的序列测定Sanger的酶法(链终止法)与gilbert（吉尔伯特）的化学法。原理：DNA的体外合成（扩增）：单链DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTP、无机离子Mg++等共有四种碱基，所以分四管合成。按一定比例加入一种2′，3′—双脱氧核苷三P（ddNTP），T，A，G，C。有几个A就有几个片段(双脱氧核苷三P随机进入)，合成的是待测链的互补链！抗癌、抗艾滋病的核苷酸衍生物药物其原理与此相同。如合成CCATTCGGA CCATTCGGA CCATTCGGA CCATTCGGAddAddTddGddCCCACCATCCATTCGCCCCATTCGGACCATTCCATTCGGCCATTC合成的各片段凝胶电泳（四个泳道一块板），因为每差一个核苷酸的片段即可分离出来，所以可由四个泳道中按核苷酸的多少直接读出序列，一次可测400多个核苷酸序列。核苷酸序列核苷酸序列 若四种双脱氧核苷酸分别用不同的荧光物质标记，合成终了的四管产物，在同一泳道电泳(毛细管)即可，可直接读出（计算机处理，人类基因组计划即是），一次可测700个核苷酸的序列。通过DNA测序可进行RNA和Pr的测序(更方便)：RNA反转录cDNA测序后按AU、GC互补配对规则推断，可知RNA的序列。蛋白质的氨基酸序列测定及RNA的序列测定也可转化为DNA来测定：Pr制备抗体提取mRNA（mRNA和将要合成完了的Pr与抗体沉淀）反转录mRNAcDNA，测序后按密码表（字典）即可推断出Pr的aa序列。反转录第三章酶第一节酶的概念新陈代谢的生物催化剂，催化特性：1.催化效率高：以分子比表示（一酶分子相当于多少无机催化剂的催化作用），酶促反应的速度比其它催化剂催化的反应速度高106—1013倍，（相对速率），如CA（碳酸酐酶）催化CO2＋H2OH2CO3比非酶催化快107（1千万）倍。转化数：单位酶单位时间催化转化的底物数量。是指酶被底物完全饱和时，每单位时间内、每个酶分子所能转化底物的分子数，称为转换数（turnovernumbeTN），也称为催化常数kcat。2.专一性强：只能作用一种或一类结构相似的化合物，发生一定的反应。如淀粉酶、酯酶、蛋白酶。均为水解酶3.要求反应条件温和，对条件变化敏感。因为酶是蛋白质或核酸（易变性失活）其结构因条件而变，进而引起其活性变化。4.酶也同细胞内其它生活物质一样不断自我更新（代谢）也受环境影响，所以易受各种因素的调节与控制。根据作用部位分为：胞外酶（分泌到细胞外发挥作用），胞内酶（在产生的细胞内起催化作用）这些酶在细胞内常有一定的分布部位：如三羧酸循环酶系、氧化磷酸化酶系都在线粒体内。第二节酶的分类与命名一、分类：根据酶所催化的反应类型分六类。1.氧化还原酶类。AH2+BA