海昆肾喜对糖尿病肾病大鼠肾组织结缔组织生长因子蛋白表达的影响

海昆肾喜对糖尿病肾病大鼠肾组织结缔组织生长因子蛋白表达的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病最严重的慢性并发症之一。肾小球硬化和肾小管间质纤维化是各种原因引起的慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的共同病理特征，糖尿病肾病也存在上述病理过程。一系列生长因子与细胞因子在此过程中发挥重要作用，而结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor,CTGF）是其中关键性的因子之一。因此本实验建立糖尿病肾病大鼠模型，研究海昆肾喜对CTGF蛋白表达的影响，探讨海昆肾喜防治DN的作用机制。材料和方法1.实验1：scxr京清洁级雄性SD大鼠60只（购自北京市维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXR京2004-0006），体质量（200±20)g，饲养于通风清洁橱中。适应性喂养1周，测体质量、尿蛋白阴性后进入实验。实验期间，自由饮水，进食普通饲料。2.免疫组化试剂海昆肾喜（吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司提供，批号：20030052）；链脲佐菌素（Sigma，批号：S0130）；厄贝沙坦（浙江华海药业股份有限公司提供，批号：S0130）。CTGF免疫组化试剂：CTGF兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗体（Ⅰ抗）（北京博奥森生物技术有限公司，批号：20060678）;HRP标记山羊抗兔IgG（Ⅱ抗）（批号：20060008）及高敏过氧化物酶复合物（SABC）（批号：060608）（武汉博士德生物工程有限公司）。微量加样器，保湿盒，37℃温箱，冰箱。3.大鼠的造模及培养60只大鼠适应性喂养1周后按体质量随机分组：正常组10只，造模组50只。造模组按55mg/kg体质量空腹一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）,72h后测血糖和尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖≥4个+者为造模成功。将造模成功的大鼠按血糖高低随机分组，分为模型组、厄贝沙坦组、海昆小剂量组和海昆大剂量组。从造模成功后，厄贝沙坦组（17.5mg/kg）、海昆小剂量组（0.77mg/kg）及海昆大剂量组（3.08mg/kg）大鼠给予相应药物灌胃治疗；其余各组大鼠给予等量生理盐水灌胃。以上各组大鼠均为分笼饲养，给予普通饲料及自由饮水，每天更换垫料，用药12周。12周末处死大鼠，无菌取肾脏，进行肾组织HE、Mallory染色，观察肾组织病理形态学改变，采用免疫组织化学方法分析肾组织CTGF蛋白的表达情况。4.观察方法和指标4.1一般条件下的情况4.224小时尿蛋白测定实验4、8、12周末用代谢笼收集24h尿液，记录尿量，用考马斯亮兰法测OD值，计算24h尿蛋白含量。4.3血液生化指标的测定用药第12周周末，进行大鼠颈动脉取血，分离血清，检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)。4.4he，蛇虫光镜下观察肾脏形态学变化和组织病理变化。4.5微波修复90-9715min石蜡切片脱蜡至水；0.01%曲拉通15min37℃；3%H2O2-甲醇20min；微波修复90℃-98℃15min；山羊血清封闭20min；滴加一抗（1∶200）,4℃过夜；滴加二抗30min37℃；滴加SABC30min37℃；DAB显色；梯度脱水封片。阴性对照，一抗用PBS代替。4.6结果的统计与分析使用ICMIAS系列多功能图像分析系统对肾组织CTGF蛋白结果进行分析，按每组大鼠随机选取5个视野对肾组织的病变情况进行分析，然后进行统计学处理。5.统计方法所有数据以SPSS11.5统计软件进行统计学处理，结果表示为x-±s，用方差分析法进行组间比较。各组大鼠体质量及肾喜小剂量的比较实验期间，模型组大鼠均出现多饮、多食、多尿及消瘦等代谢紊乱的症状，体毛减少、凌乱，活动减少；并随时间的推移出现糖尿病的各种并发症状，如眼部出现白内障以及面部、颈部、生殖器及尾部等的感染症状等。各治疗组大鼠的整体状况均有改善，其中以海昆肾喜大剂量组为优。造模后的各组大鼠的体质量与正常组大鼠比较，每周体质量均明显减少，厄贝沙坦组、海昆肾喜小剂量组及海昆肾喜大剂量组大鼠的体质量较模型组有所提高，肾脏肥大指数也较模型组显著减小（见表1）。见表2。造模大鼠在造模4周后，24h尿蛋白显著增多，而且逐周加重。厄贝沙坦组、海昆肾喜小剂量组及海昆肾喜大剂量组大鼠24h尿蛋白的排泄量均较模型组有所改善，在此时间段，厄贝沙坦组和海昆肾喜大剂量组大鼠的尿蛋白均较模型组显著减少（P<0.01），在第12周海昆肾喜小剂量组大鼠的尿蛋白也较模型组减少（P<0.05）。正常组可见正常结构的肾小球和肾小管。模型组大鼠肾小球球囊壁粘连增厚，肾小囊扩张，系膜细胞及基质重度增生，毛细血管腔重度扩张，肾小球重度纤维化；肾小管扩张，上皮细胞空泡样变。厄贝沙坦组肾小球球囊壁轻度粘连增厚，系膜细胞及基质中度增生，毛细血管腔轻度扩张，肾小球中度纤维化；个别肾小管上皮细胞空泡样变。海昆肾喜组肾小球系膜基质轻度增厚，球囊壁轻度增厚，肾小囊轻度扩张，个别肾小管上皮细胞空泡样变，肾小球轻中度纤维化，并以海昆肾喜大剂量组改善明显。5.肾间质细胞ctgf表达见表3。正常组大鼠肾组织中肾小管上皮细胞、肾间质细胞及肾小球系膜细胞胞浆中有少量的CTGF表达；模型组与正常组相比较，肾小管上皮细胞和肾间质细胞胞浆中CTGF呈强阳性表达，也有一些肾小球系膜细胞胞浆内CTGF表达上调；厄贝沙坦组和海昆肾喜小、大剂量组CTGF的表达与模型组相比显著减少，且三者间无统计学差异。ctgf与肾衰1988年Almendral等首先发现了小鼠的CTGF,1991年Bradham等在人类脐静脉内皮细胞条件培养基中首次发现了人类的CTGF。在人类，CTGF广泛存在于多种组织器官中，以肾脏含量最高。正常生理情况下体内的CTGF表达很低。细胞通过胞饮方式CTGF从细胞表面进入细胞内，然后聚集在细胞核周围，在胞浆中通过激活蛋白激酶或直接影响细胞的转录而发挥作用，主要表现介导细胞黏附、迁移和增殖、分化、存活的功能，均通过细胞与基质之间作用实现。DN的病理特征是肾小球硬化和肾小管纤维化。在这两种病理过程中，CTGF都起着重要的作用。DN肾小球硬化的直接原因是肾小球系膜细胞的细胞外基质（ECM）沉着，在这个过程中，TGF是致肾小球硬化的最强的细胞因子。实验研究表明，TGF的促胶原蛋白合成作用可以完全被CTGF中和性抗体或者CTGF反义核酸所阻断。CTGF作为TGF的下游调节因子，介导和调节着TGF的促胶原合成与致硬化作用。另有研究表明，在没有TGF存在的实验条件下，CTGF可以直接上调系膜细胞中黏连蛋白(FN)、纤溶酶原激活物抑制因子以及1型胶原和4型胶原在系膜细胞外的积聚，说明CTGF在TGF途径之外本身可以有致硬化作用。目前认为，肾功能衰竭的发生与发展和肾小管间质的纤维化密切相关。研究发现肥胖型糖尿病db/db模型小鼠肾皮质和肾小球的CTGFmRNA含量明显高于正常小鼠对照组；当DN处于早期阶段，系膜增生尚轻微，也还未见间质病变和蛋白尿时，在肾小球区的CTGF表达就已经升高了。临床研究发现在1型糖尿病患者的尿液检测中发现CTGF，提示CTGF可作为DN进展的监测指标。由此可见，CTGF在DN发生发展过程中起着极其重要的作用。“海昆肾喜”的主要成分是褐藻多糖硫酸酯，它是褐藻类海藻特有的化学物质，是一种水溶性杂聚糖，主要成分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，其次还伴随有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖及蛋白质、钾、钠、钙、镁等金属离子，它的结构特征为1,2-联结的聚-α-L-吡喃褐藻糖，而硫酸酯在C-4位的羟基上。是治疗慢性肾衰竭和早期尿毒症的国家二类中药新药。有实验研究显示褐藻多糖硫酸酯能够中和清除代谢废物，不仅具有降低血脂、抗血小板聚集、改善血液流变学的作用，而且具有重建受伤的肾小球基底膜负电荷屏障的作用，能够防止系膜基质扩张和基底膜增生，从而减少尿蛋白量，保护肾功能；此外临床研究表明海昆能够增加肾脏血流量、增强免疫，还能促进受损细胞修复，能明显改善各种原因（包括DN）导致的慢性肾衰患者的消化道症状，降低Scr和BUN，同时升高血红蛋白和血浆白蛋白，使肾衰患者营养状况得到明显改善。由此可见，海昆肾喜临床治疗DN有确切疗效，因此笔者采用海昆肾喜作为实验用药。通过笔者的实验研究表明，从一般状态观察发现海昆肾喜能够改善DN大鼠体质量减轻、体毛凌乱、饮食活动、各种感染等整体状态；从各项指标的检测发现海昆肾喜能够明显减少DN大鼠24h尿蛋白的排泄，调节DN大鼠血脂异常，降低其血清中TG的浓度（且存在一定的量效关系，大小剂量之间存在差异，P<0.05），能够降低DN大鼠Scr和BUN，改善肾功能；从肾脏病理图片观察发现海昆肾喜能够抑制DN大鼠肾小球系膜细胞及基质增生、球囊壁增厚以及肾小管细胞的扩张和空泡样变，延缓肾脏纤维化的进程，对肾脏有明显的保护作用；从免疫组化方法中CTGF蛋白的表达情况来看，海昆肾喜对DN大鼠肾脏保护作用的机制可能是通过抑制肾组织CTGF的过度表达，进而延缓DN