基于线粒体dna技术的雪豹panmaeauncia微卫星遗传多样性分析

基于线粒体dna技术的雪豹panmaeauncia微卫星遗传多样性分析

流域主要分布在亚洲12个国家的高海拔山区（sunquitandsunquit，2002）。与世界其他猫科动物一样，雪豹也受到密度低、活动范围广、猎物数量减少、狩猎和其他因素的威胁。由于受到地理范围、难以捕获等原因的限制,目前关于雪豹的生态行为、详细分布范围、生存现状和种群状况等的研究报道很少。有关雪豹的研究仅依赖于间接的证据,例如痕迹(例如足迹、擦痕、尿迹、抓痕等)和对当地居民的走访等(Schaller,1998;Ale,2007)。痕迹仅能对雪豹种群提供定性的数据,而不能跟踪监测雪豹种群的数量波动(WilsonandDelahay,2001)。Jacksonetal.(2006)应用红外照相监测技术在印度Ladakh的Hemis国家公园进行了雪豹数量调查研究,但该技术存在野外工作时间长、难以在崎岖的雪豹栖息地架设照相机和移动照相机、以及费用高等缺点。近年来,随着分子生物学技术的日益发展,分子生物学研究和越来越多的学科相结合,大大扩展了原有的研究范围。粪便DNA分析技术以动物的粪便为研究材料,应用分子生物学手段研究动物的DNA,从而获得有关动物的遗传信息,这是一项新发展起来的保护遗传学研究技术(王戎疆,2001)。通过对粪便DNA中多种遗传标记的识别,研究者可以对野生动物的种群数量调查、领域边界划定、生活史、种群遗传结构和遗传多样性等方面进行深入的研究(魏辅文等,2001;吴、张恩迪,2005),研究者越来越普遍应用非损伤性采样(粪便和毛发等)和分子方法研究濒危物种的遗传多样性(WaitsandPaetkau,2005;Schwartzetal.,2007),这为雪豹的种群监测和遗传多样性研究提供了有效的途径。本研究通过应用雪豹线粒体、微卫星位点和Y-染色体的特异性引物,对3个雪豹分布地理隔离区的粪便样品进行物种和性别鉴定,利用筛选的微卫星引物进行遗传多样性初步研究,试图建立适合于雪豹种群监测和遗传多样性研究的非损伤性方法,为开展大范围的雪豹种群研究和制定保护策略提供科学依据。1材料和方法1.1调查区域和方法于2005年分别在中国、印度和蒙古3个独立的雪豹隔离分布区采集雪豹的粪便样品109份,其中印度的Ladakh32份、中国青海省都兰县50份、蒙古国的南Gobi27份。在每个样品采集区,采集样品的范围约25km2,由当地经验丰富的居民引导。Ladakh的调查区域在海拔3950-4420m,青海为3135-3930m,南Gobi为2000-2500m。所有粪便样品保存在含有大约12ml硅胶的15ml试管中,室温保存。应用QiagenStoolDNA试剂盒(Qiagen,Valencia,California,USA)提取粪便样品DNA,同时以圣地亚哥动物园和濒危物种繁殖中心的2个雪豹(1雌1雄)冰冻组织样品作为对照。1.2pcr扩增选择线粒体cytb基因的通用引物(Farrelletal.,2000)进行粪便样品的鉴定,该引物的扩增产物约为148bp。PCR反应体积为10μl,体系中含有0.2mmol/L的dNTPs、1×PCRbuffer,0.25U的HotMasterTMTaq(Eppendorf),1μg的BSA,0.24mmol/L的引物和1μl模板DNA。PCR反应条件为94℃预变性1min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸2min。应用1.2%琼脂糖凝胶电泳,PrepEasePCR(USBCorporation,USA)试剂盒纯化PCR产物,然后将PCR产物进行测序。将测序后的DNA序列在GenBank数据库中进行Blast比较,以确定粪便样品的来源物种。1.3ss-pcr扩增经鉴定后确定的雪豹粪便样品,应用Janekaetal.(2008)新设计的7对微卫星引物进行雪豹样品的基因分型分析。PCR扩增体系为10μl,反应体系体系中含有0.2mmol/L的dNTPs、1×PCRbuffer,0.25U的HotMasterTMTaq(Eppendorf),1μg的BSA,0.24mmol/L的正向荧光标记引物和0.24mmol/L的反向引物,1μl模板DNA。PCR反应条件为94℃预变性1min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸2min。PCR产物在ABI3730测序仪上分型分析,通过GeneMapper(Version4.0;AppliedBiosystems)确定等位基因大小。只得到一条PCR产物带的判定为纯合子,有2条产物带的判定为杂合子。1.4资料处理和分子鉴定对所有鉴定后确定的雪豹粪便样品,进行性别鉴定。应用猫科动物的特异性引物(Murphyetal.,1999)进行性别鉴定,扩增产物为200bp的AMYELY基因片段。PCR条件与上述的线粒体DNA条件相同,每个扩增设置3个重复,并有1雄、1雌作为阳性和阴性对照。用1%琼脂糖凝胶检测PCR产物,3个重复中至少有2个具有明显扩增产物的样品被判定为雄性,如果3个重复中都没有产物的被判定为雌性。1.5pcr检测ndb基因的多样性通过Sequencher进行线粒体DNA序列分析,去掉测序产物中的引物和不明确的片段,与GenBank数据库中找到的参照序列在ClustalW1.83中进行比对。为了检测线粒体DNA的序列差异,应用DNASP4.0进行碱基的配对和单倍型分析,并计算mtDNA序列的单倍型多样性和核苷酸多样性(π)等。应用7对微卫星位点引物,对cytb基因分析确认的雪豹样品进行了基因分型。当3个PCR重复中获得至少2个清楚的PCR产物,并且每个等位基因观察到2次或以上,而纯合子的等位基因观察到3次时,确定为基因分型成功。应用GenAlex(Version6.0)计算微卫星的等位基因数(AN)、观察杂合度(HO)、预期杂合度(HE)和哈温平衡。2不同性别和异质性的基因型分析所有采集的粪便样品中,80%的样品获得了良好的扩增结果,可以用于物种鉴定,成功率为72%-89%。在鉴定的Ladakh的32个样品中有17个确定是雪豹,其它有6个赤狐和2个狼/狗;来自青海的36个样品中有3个为雪豹、10个猞猁、21个赤狐,另外2个样品为狼或狗;而蒙古国南Gobi的24个样品中有11个雪豹和13个赤狐。在3个地区的雪豹样品中仅得到1个cytb基因的单倍型,而猞猁中有2个(π=0.030),赤狐中有4个(π=0.017),狼/狗中有2个(π=0.010)单倍型。利用筛选到的7对雪豹微卫星引物,对确定的31个雪豹粪便样品进行基因分型,通过个体识别,确定这些样品中的真正雪豹数量。印度Ladakh和蒙古国南Gobi的基因分型成功率分别为12个(71%)和9个(82%)(表1),青海为1个。在Ladakh和南Gobi的样品中,总共检测到9个不同的基因型:Ladakh有4个,南Gobi为5个。因此,在Ladakh中的雪豹粪便样品分别来自4只不同的雪豹个体,而南Gobi中雪豹粪便样品则来自5只不同的雪豹个体(表1)。为了确定检测到的雪豹的性别,使用与Y染色体的AMELY基因进行了性别鉴定,结果在Ladakh样品中检测到2只雄性和2只雌性雪豹,而南Gobi样品检测到3只雄性和2只雌性雪豹(表1),在青海省的样品中检测到1只雄性雪豹。应用7对特异性微卫星引物进行遗传多样性研究,分别计算了各个位点的等位基因数、观察的杂合度、预期的杂合度和哈温平衡等(表2)。结果表明:7个微卫星位点在Ladakh和南Gobi样品中均具有多态性,等位基因数为2-4个,其中PUN327位点在两地样品中的等位基因数均最多,而PUN82位点在两地样品中的等位基因数均最少,Ladakh和Gobi样品的平均等位基因数分别为3.1和2.5。在Ladakh样品中共检测到9个特异等位基因,分别来自PUN124、PUN132、PUN225、PUN229和PUN327;而南Gobi样品检测到5个特异等位基因,分别来自PUN124、PUN132、PUN229和PUN327。因此,在PUN124、PUN132、PUN229和PUN327这些微卫星位点,更容易产生变异,具有更高的多态性。在Ladakh和Gobi样品中观察的平均杂合度分别为0.75和0.51,而预期的杂合度分别为0.58和0.44。因此,等位基因数和杂合率在南Gobi样品中都较低,同时,所有的微卫星位点都符合哈温平衡,Ladakh和Gobi区域的FST值是0.171。3检测的准确性和非损伤性本研究应用线粒体DNAcytb基因通用引物进行粪便样品的物种鉴定研究,该引物曾经被成功地用于南美洲肉食动物等的粪便样品鉴定。本研究的结果表明,该引物同样适用于亚洲雪豹、赤狐、狼/狗和猞猁等粪便样品的物种鉴定。通过cytb基因引物成功地鉴定了80%的粪便样品,与其它的肉食动物的研究平均值相近(85.7%;Broquetetal.,2007)。青海的取样区检测到的雪豹粪便最少,仅为3个粪便样品,而且鉴定成功率也最低,这可能是由于该地区的粪便样品在野外暴露的时间过长,或者是受到雨水冲刷等原故。而鉴定的样品中,赤狐和猞猁的数量均比雪豹数量高,因此,该地区可能有较多的赤狐和猞猁数量。而蒙古国的南Gobi地区得到的赤狐和雪豹样品基本相等,而且狐狸的粪便样品都是有规律地在雪豹的痕迹地点被发现。因此,利用这些粪便样品进行物种鉴定是可靠的。在经过cytb基因成功鉴定后的样品中,应用7个微卫星引物分别在印度Ladakh的17个粪便样品中检测到4个不同的基因型,而蒙古国南Gobi的11个粪便样品中有5个不同的基因型,青海都兰的3个粪便样品中仅检测到1个基因型。因此,在相同面积的样品收集区域内,蒙古国南Gobi和印度Ladakh可能存在较青海地区更大的雪豹种群。尽管此次研究中最后共计只得到10个雪豹个体样品,但取样区均在25km2范围内,根据猫科动物的活动习性,不可能有更多的雪豹个体存在,因此,这两个地区的雪豹种群密度实际上已经较高。通过使用性别鉴定标记基因,在印度Ladakh和蒙古国南Gobi检测到的雌雄雪豹数量基本相同,这表明,在这两个地区的雪豹种群中,雌雄性别比基本相同。由于本研究样品收集的范围较小,所以还不能完全确定该性别比的准确性。微卫星基因分型的错误可能会对种群大小估计造成偏差(McKelveyandSchwartz,2004),已有的非损伤性(粪便、毛发样品)研究表明,微卫星分型分析中存在较多的等位基因丢失和假等位基因现象(Broquetetal.,2007),这些可能是由于非目标DNA、目标DNA质量和数量较低以及PCR抑制等造成的(Taberletetal.,1999)。尽管这些原因导致了基因分型的错误,但是还不能完全解释位点特异性的错误(Broquetetal.,2007)。已有的非损伤性研究没有考虑微卫星重复单位的作用和微卫星引物的序列差异,这可能是PCR不能进行位点特异性扩增、等位基因丢失和假基因等现象的原因(Lopex-Giraldezetal.,2006)。本研究使用根据家猫微卫星位点引物重新设计的引物,降低了这种特异性错误,从而表明等位基因丢失和假等位基因的现象可能是由于微卫星引物区的基因突变等原因导致的(Janetal.,2008)。印度Ladakh和蒙古国南Gobi的雪豹粪便样品在7个PUN引物中的基因分型成功率分别是75%和84%,高于其它非损伤性方法的研究结果(Broquetetal.,2007)。这7对重新设计的雪豹微卫星引物具有较低的等位基因丢失和假等位基因现象,对Ladakh和南Gobi的雪豹粪便样品的个体鉴定提供足够的灵敏度(PID-sib<0.05)。如果使用更多的微卫星位点将更加有利,特别是对遗传多样性水平较低的种群。由于有限的样品数而无法进行雪豹种群水平遗传多样性分析比较,尽管研究的3个样品区距离远(>1000km)且有天然的地理阻隔(例如喜马拉雅山脉等),但是没有检测到确定的单倍型差异。与线粒体相比较,7个微卫星位点在印度Ladakh和蒙古国南Gobi样品中的杂合度均处于中等程度,表明这2个种群都具有中度的多样性。蒙古国南Gobi样品的微卫星多样性水平低于印度Ladakh,然而,由于样品数的限制而无法进行统计比较。本研究初步探讨了3个独立的雪豹栖息区域的粪便样品,说明了使用粪便DNA分析方法在雪豹种群数量调查和遗传多样性研究中的